MIKROSKOPIE & BILDANALYSE

- eine Art der Kultur-Revolution Mikro-Slides

20.04.2005 | Redakteur:

Das Instrumentarium zur optischen Analyse zellulärer Prozesse hat sich in der letzten Dekade rasant verändert.

Das Instrumentarium zur optischen Analyse zellulärer Prozesse hat sich in der letzten Dekade rasant verändert. Da wurde es Zeit, endlich Trägersysteme zu entwickeln, die genau auf die Bedürfnisse moderner Zellforschung und des Imagings zugeschnitten sind.

Mit der Frage, wie die Zellkultur-Slides der Zukunft auszusehen hätten, beschäftigt sich seit einigen Jahren ein junges Unternehmen, das als Ausgründung aus dem Biophysik-Department der Universität München hervorgegangen ist. Der Name „ibidi“ - zentralsymmetrisch designed - steht für „integrated biodiagnostics“ und verweist auf die erste Intention der Firmenprojekte: Materialwissenschaftliches und biologisches Wissen zusammenführen, um Testsysteme für Diagnostik und Forschung zu entwickeln. Inzwischen kam, als weiterer Schwerpunkt, die Verbesserung der optischen Analytik von Zellkulturen dazu.

Ausgangspunkt für ibidi waren die Probleme, die sich aus den traditionell für Zellkulturen verwendeten, offenen Testgefäßen ergaben: Diese sind nicht nur anfällig für Kontaminationen, bei ihnen treten, bedingt durch die Oberflächenspannung, auch Randeffekte auf. Im Gefolge verteilt sich das biologische Material ungleichmäßig, das Zellwachstum neigt zur Inhomogenität und auch die optische Analyse wird durch Verzerrungen beeinträchtigt.

Daher war bereits ein wichtiges Konstruktionsprinzip für den zu entwickelnden Slide klar: Ein geschlossener Hohlraum ist erforderlich, denn nur in ihm lässt sich eine durchgehend plane Oberfläche erzielen. Ein solches, nach außen abgedichtetes System hat dazu den Vorteil, optimal gegen Verdunstung und Kontaminationen geschützt zu sein.

Von der Kultur direkt zum Bild

Das Material, aus dem die idealen Zellkultur-Träger zu realisieren wären, sollte dreierlei Ansprüchen genügen: Die Adhäsion von Zellen ebenso ermöglichen wie einen ausreichenden Gasaustausch, und dank seiner optischen Eigenschaften eine Beobachtung von außen zulassen. Neueste Fluoreszenz- Methoden, das Evaneszenzfeld-Verfahren und die Konfokale Mikroskopie haben hier die Anforderungen vorgezeichnet.

Konventionelle Kunststoffe bilden mit ihrer unregelmäßigen Struktur und durch seitliche Molekülketten „wirre“ Geflechte, an denen sich Lichtstrahlen stark brechen. Das mindert die Qualität optischer Analysen erheblich. Anders die Verhältnisse bei dem Polymer, das ibidi für die µ-Slides verwendet. Dieser Kunststoff zeichnet sich dadurch aus, dass sich in ihm die Molekülfäden in parallelen Bahnen zusammenlagern und keine Seitenketten besitzen. Dadurch sind die Brechungseffekte des Lichts beim Durchstrahlen des Materials relativ gering. Neben ihren guten optischen Eigenschaften sind die 175 µm dicken Böden der µ-Slides genügend durchlässig, um selbst bei Langzeitversuchen immer einen ausreichenden Gasaustausch zu gewährleisten. Für Versuche mit Zellkulturen ist auch die Beschaffenheit der inneren Oberflächen wichtig: Die Zellen sollen, besonders bei Tests mit Strömungsbelastungen, gut an den Wänden anhaften. Für die µ-Slides stehen wahlweise verschiedene Standard-Coatings - wie Collagen IV, Poly-L-Lysine und Fibronectin - zur Verfügung. Als zusätzliche Option wurde gerade erst eine eigene Oberflächenbehandlung mit der Bezeichnung ibiTreat zur Marktreife entwickelt. Über deren Eigenart, den Zellen zum „Andocken“ zu verhelfen, verrät der Hersteller nur, dass sie rein physikalischer Natur ist.

Mit ihren geschlossenen Kammern eignen sich die µ-Slides ideal zur Funktionsanalyse lebender Zellen. Als Durchfluss-Vorrichtungen konzipiert, erlauben sie einen geregelten Austausch von Flüssigkeiten. Dabei können die Slides über Luer-Adapter problemlos an andere Systeme, wie Spritzen oder Pumpen, angeschlossen werden. Die in den µ-Slides enthaltenen Kanäle und Reservoirs sind so ausgelegt, dass die Zellen auf dem gleichen Substrat wachsen können, auf dem sie später auch fixiert, angefärbt und dem Imaging unterzogen werden. Ein Transfer der Zellen auf Deckgläschen für solche weiterführenden Arbeitsschritte ist daher unnötig. Mit den Mikro-Slides liegt also eine Plattform vor, die ohne problembehaftete Umwege von der Kultivierung direkt bis zum hochauflösenden Bild führt.

Bewegende Vorgänge

Ein besonderer Fokus der internen Forschungsprojekte des Unternehmens liegt auf chemotaktischen Assays. Verwendet werden dazu Chemokine, also Substanzen, die eine gerichtete Bewegung von Zellen induzieren. Werden solche Chemokine von einer Seite in einen µ-Slide I eingebracht, bildet sich in dem Kanal ein über längere Zeit stabiler Gradient. Die Aktivität der Zellen kann über diesen Zeitraum direkt unter dem Mikroskop verfolgt werden. Gearbeitet wird dabei beispielsweise mit dem Schleimpilz Dictyostelium discoideum, der in einem c-AMP-Gradienten migriert.

Bei solchen Untersuchungen zur Chemotaxis handelt es sich zunächst um Grundlagenforschung. Doch dahinterliegende Anwendungen in Pharmazie und Medizin sind durchaus greif- und denkbar, denn die Mechanismen, die das Zusammenwirken von Chemokinen und Zellbewegungen bestimmen, spielen beispielsweise eine Rolle bei der Immunstimulation oder bei der Gefäßbildung in Tumoren. Gerade für die Angiogenese-Hemmung zur Tumorbekämpfung ist ein genaueres Verständnis der Migrations-Vorgänge erwünscht.

Ein noch ungelöstes Problem ist, dass solche Chemotaxis-Studien bislang nur bei sich relativ schnell bewegenden Zellen funktionieren. Dazu gehören Dictyostelien, Makrophagen oder Neutrophile, nicht aber „langsame“ Zellen, wie die von Tumoren. Die Zellen bewegen sich nämlich nur so lange gerichtet, wie lediglich der eine Zellpol mit dem Chemokin-Gradienten in Berührung steht, der Rest der Zelle dagegen noch nicht. Befindet sich die Zelle komplett im Gradienten, verliert sie die Orientierung. Um einmal die Geschwindigkeits-Unterschiede zu verdeutlichen: Eine „schnelle“ Zelle bewegt sich pro Minute um eine Zelllänge (das sind etwa 10 µm); da lässt sich ihre Bewegung im Verhältnis zum sich weiterentwickelnden Gradienten wahrnehmen. Bei einer „langsamen“ Zelle, die für die gleiche Strecke eine Stunde braucht, ist das bisher nicht möglich.

Mit dem µ-Slide VI flat liegt ein System vor, mit dem sich Immunfluoreszenztests schnell und einfach durchführen lassen. In sechs parallelen Kanälen können jeweils circa 10 000 Zellen in einem Volumen von nur 25 Mikroliter ausgesät werden, wobei ein mikroskopisch zugänglicher Bereich von 100 Quadratmillimetern pro Kanal vorhanden ist. Alle für eine Fixierung gängigen Standardmethoden können genutzt werden, da das Material der Slides gegen die verwendeten Lösungen (Methanol, Aceton, Paraformaldehyd u.a.) resistent ist.

Durch die kleinen Kanalvolumina werden nur geringste, mithin kostenersparende Mengen an Färbelösung benötigt. Dank ihrer Kanalgeometrie sind die µ-Slides besser vor Kontaminationen geschützt als konventionelle Sechs-Well-Platten. Die Waschschritte sind einfach und reproduzierbar. Auf einem µ-Slide können an den gleichen Zellen unterschiedliche Protokolle angewandt, die Konzentrationen der Immunfluoreszenzlösungen oder der Antikörper variiert werden.

Toxikologisches Screening

Ein weiterer großer Anwendungsbereich sind toxikologische Screening-Experimente, die mit Wirkstoffkandidaten oder Umweltgiften durchgeführt werden. So konnten in Strömungsexperimenten Schwermetallsalze zu Zellen zugespült werden und deren Apoptose (über genetische Mechanismen geregeltes Absterben der Zellen) in Abhängigkeit von der Konzentration des zugegebenen Schwermetallsalzes analysiert werden. Hierfür werden vor allem µ-Slide I und µ-Slide VI flow eingesetzt, in die die Zielzellen eingebracht werden. Im Rahmen eines solchen Screenings ermöglichen die Durchflusskammern die kontrollierte Zugabe der Wirkstoffkandidaten. Die Auswirkungen können mit Hilfe der Flow kits direkt unter dem Mikroskop verfolgt werden.

Da alle durchgeführten Verfahren in Echtzeit unter dem Mikroskop zu beobachten sind, lassen sich die Messungen in den parallelen zellbasierten Assays innerhalb von Stunden optimieren; ansonsten benötigen diese Prozeduren mehrere Tage. ?Simulation von Blutgefäßen?Ein bestimmter Anwendungsbereich des „µ-Slide I“ ergibt sich aus der Möglichkeit, primäre Endothelzellen, wie HUVECs (Human Umbilical Vein Endothelial Cells) unter Flussbedingungen zu kultivieren. Beim zweimaligen Aussähen von Zellen bildet sich ein Kanal, dessen gesamte Oberfläche mit den Nabelschnurgefäßzellen ausgekleidet ist. Auf diese Weise lassen sich Modellsysteme für Blutgefäße nachbilden, an denen Interaktionen von Blutkomponenten mit den Gefäßwänden getestet werden können.

Einen wesentlichen Beitrag zur Arterioskleroseforschung liefert das y-förmige µ-Slide. In diesem sind die Kanäle so angelegt, dass sie in einem doppelten „Y“ zusammenlaufen. Die eine Gabelung bildet dabei einen 30°, die andere einen 40° Winkel. Damit lassen sich erstmalig mit einer „ready to use“-Perfusionskammer Gefäßverzweigungen simulieren. An diesen Stellen ändert sich in Blutgefäßen unter In-vivo-Verhältnissen das Strömungsverhalten stark und an den Rändern fällt der Fluss auf nahezu Null Milliliter pro Minute. Dabei bilden sich unter anderem arteriosklerotische Plaques, die im Extremfall bis zum Infarkt führen können.

Mit den µ-Slides lässt sich diese Situation zum ersten Mal direkt unter dem Mikroskop verfolgen. So können Wirkstoffe, die solche Plaques zur Auflösung bringen sollen, in parallelen zellbasierten Assays getestet werden. Ein weiterer interessanter Aspekt bei der Arbeit mit Blutgefäß-Simulationen - immerhin sind drei der vier Firmengründer Physiker - betrifft die Untersuchung von auftretenden Scherkräften. Solche mechanischen Stressoren stehen im Verdacht, entzündliche Prozesse auszulösen, dienen aber auch wesentlich dazu, im Endothelium Zell-Zell-Wechselwirkungen zu steuern.

* Dr. H. Bruckner, Redaktionsbüro BioScript, München