Mykotoxine

Hochtoxische Mykotoxine genau quantifizieren

12.09.2008 | Autor / Redakteur: Wolfgang Brodacz* /

Bei der Massenspektrometrie gilt ein SIM-Ion als ein Identifizierungspunkt (Hochauflösung zählt hier doppelt). Die LC/MS/MS mit einem Vorläuferion (precursor) und zwei Übergangsprodukten („Töchter“) liefert vier IPs und bei zwei Vorläuferionen mit je einem Übergang sogar fünf Identifizierungspunkte (MRM-Modus). Jeweils vier IPs können auch durch Kombination von zwei EI-SIM mit zwei CI-SIM (CI chem. Ionisation) in der GC/MS erreicht werden bzw. durch die Parallel-analyse mit GC/MS und LC/MS mit jeweils zwei SIM-Spuren (s. Tab. 1).

Auf die GC/MS-Analytik von Mykotoxinen angewandt, bedeutet diese Vorgabe drei SIM-Spuren, wobei ein Target zur Quantifizierung von zwei Qualifiern bestätigt wird. Die Auswahl der „diagnostischen“ Ionen sollte dabei die Grundregeln der 2002/657/EC berücksichtigen, d.h. es werden (falls vorhanden) das Molekularion M+ und direkt daraus abgeleitete charakteristische Fragmente bevorzugt. Am Beispiel des silylierten B-Trichothecens Fusarenon X zeigt Abbildung 3 eine mögliche Auswahl (570, 555 und 480). Während für die Zielanalyten T-2 Toxin bzw. HT-2 Toxin drei SIM-Spuren gemessen werden (s. Abb. 4, oben), würde theoretisch für die internen isotopenmarkierten Standards je ein diagnostisches Ion (Target) ausreichen. Da sich aber die gesamte Quantifizierung auf dieses eine Signal bezieht, wird aus Sicherheitsgründen zusätzlich ein Qualifierion gemessen. So kann über deren Verhältnis kontrolliert und dokumentiert werden, dass das Quantifizierungs-Chromatogramm (Target des internen Standards) nicht durch die Matrix gestört wird (s. Abb. 4, unten).

Hohe Nachweisempfindlichkeit durch GC/MS

Obwohl die EI-Spektren der TMS-Derivate der Zielanalyten kein dominantes Molekularion zeigen und relativ stark fragmentiert sind [4], gelingt es durch die Gesamtselektivität der Methode und die hohe Anreicherung (0,1 ml Messlösungsvolumen) eine sehr gute Nachweisstärke zu erzielen. Aus den Streudiagrammen der umfangreichen Validierung ergibt sich bei T-2 Toxin bzw. HT-2 Toxin eine Bestimmungsgrenze (BG) von 2,2 bzw. 1,1 µg/kg Matrix und eine Nachweisgrenze (NG) von 0,7 bzw. 0,3 µg/kg Matrix. Um die Anwendbarkeit der Methode auch unter Worst-case-Bedingungen im Routinebetrieb zu gewährleisten, wurde für beide Zielanalyten die BG mit 4,5 und die NG mit 2 µg/kg sehr konservativ festgelegt. Die SIM-Chromatogramme einer natürlich kontaminierten Gerste mit sehr geringen Gehalten zeigen in Abbildung 4 die robuste Festlegung und die hohe Nachweisstärke der GC/MS-Methode. Tabelle 2 zeigt eine Gegenüberstellung der von der EU für Wiederfindung und RSDr (relativer Standardabweichung) vorgegebenen Kriterien mit den erzielten Methodenkenndaten [6]. Trotz komplexer Aufarbeitung und hoher Anreicherung mit entsprechender Matrixbelastung der Messlösungen werden sehr zufriedenstellende Rückgewinnungen und Variationskoeffizienten erreicht (Validierungsdaten mit 35 Proben aus vier unterschiedlichen Matrizes in Tabelle 2).

Methoden-Kurzübersicht mit Aliquotierungen

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