Worldwide China

Gradienten effizienter nutzen

Gradientenvolumen-Konzept optimiert die Flüssigchromatographie

| Autor / Redakteur: Frank Steiner, Markus M. Martin* / Marc Platthaus

Konkretes Beispiel für die Anpassung aller Methodenparameter bei der Übertragung einer Gradientenmethode auf eine kleinere und effizientere Säule (der Link www.separatedbyexperience.com/products/GradientMethod.aspx führt zu einem Internet-basierten Methodenkonversions-Rechner).
Bildergalerie: 2 Bilder
Konkretes Beispiel für die Anpassung aller Methodenparameter bei der Übertragung einer Gradientenmethode auf eine kleinere und effizientere Säule (der Link www.separatedbyexperience.com/products/GradientMethod.aspx führt zu einem Internet-basierten Methodenkonversions-Rechner). (Bild: Thermo Fisher Scientific)

Die Reproduzierbarkeit und Genauigkeit einer HPLC-Trennung hängen in hohem Maße von der Zusammensetzung des Eluenten bzw. jeweiligen Lösungsmittelgemisches ab. Lesen Sie in unserer HPLC-Serie, wie Sie mithilfe eines Gradientenvolumen-Konzeptes Ihre Trennung optimieren.

Im Unterschied zu isokratischen Trennungen spielt bei Gradientenmethoden in der Flüssigchromatographie neben der Flussrate auch die Änderung der Laufmittelzusammensetzung über die Zeit eine Rolle. Eine reine Flusserhöhung wird die Analyse im Gradienten nur unerheblich beschleunigen, während es bei isokratischen Methoden dabei eine strenge Proportionalität gibt. Weil eine Substanz erst beim Erreichen einer bestimmten Eluentenstärke im Gradienten merklich auf der Säule bewegt wird, ist es für die Analysendauer kaum von Belang, mit welcher Geschwindigkeit das Laufmittel transportiert wird. So wie die entscheidende Elutionszusammensetzung erst zu einer bestimmten Zeit von der Gradienten-Pumpe gemischt und zur Säule gefördert wird, wird die entsprechende Substanz nicht vor diesem Zeitpunkt durch die Säule wandern, auch nicht bei höherer Flussrate. Deshalb müssen Flussrate und Gradientenprogramm stets abgestimmt verändert werden.

Eine Verkürzung der Säulenlänge unter Erhalt der Flussrate führt bei isokratischen Trennungen zu einer Beschleunigung der Analyse, genau um den Faktor, mit dem die neue Säule kürzer gewählt wurde. Wird bei einer Gradientenmethode auf eine kürzere Säule gewechselt, muss stets die Steigung des Gradienten um den gleichen Faktor erhöht werden, wie die Säule verkürzt wurde.

Gradientenvolumen genauer betrachtet

Zum Übertragen von Gradiententrennungen auf andere Flussraten oder Säulen­dimensionen hilft die Beachtung des so genannten Gradientenvolumen-Konzepts. Wie ist dieses definiert? Das Gradientenvolumen VG ist das gesamte Volumen an mobiler Phase, das während der Gradientenphase durch die Säule gepumpt wird. Es entspricht dem Produkt aus der Flussrate F und der Dauer des Gradienten tG (bzw. eines Gradientensegmentes bei Stufen- oder Mehrsegmentgradienten).

Die erste Regel im Sinne des Gradientenvolumen-Konzeptes besagt, dass bei Veränderung der Flussrate auf einer gegebenen Säule stets das Gradientenvolumen konstant gehalten werden muss.

Es sei kurz die Frage beleuchtet, wie relevant Flussraten bei Gradientenmethoden im Hinblick auf die Qualität der Trennung sind, also die chromatographische Auflösung in Abhängigkeit von der Flussrate. Grundsätzlich gibt es auch für Gradiententrennungen eine optimale Flussrate. Sie entspricht dem in isokratischen Experimenten ermittelten Minimum der van-Deemter-Kurve, wenngleich Gradientenmethoden keine Bestimmung von Bodenzahlen oder Bodenhöhen erlauben. Sollte bei Gradientenmethoden abweichend von der optimalen Flussrate gearbeitet werden, ist der negative Effekt auf die Trennung wesentlich geringer ausgeprägt. Dies liegt daran, dass Substanzzonen beim Wandern durch die Säule aufgrund der ständigen Erhöhung der Elutionskraft permanent fokussiert werden. Dieser Effekt wirkt der üblichen Bandenverbreiterung entgegen und gestaltet die Auflösung bei Flussratenänderung in Gradientenmethoden deutlich robuster als bei isokratischer Arbeitsweise. Unter strengem Einhalten des Gradientenvolumen-Konzeptes sei der Anwender also auch ermutigt, deutlich höhere Flussraten bezüglich ihrer Anwendbarkeit zu testen.

Die zweite Regel widmet sich dem Übertragen von Gradienten auf Säulen anderer (typischerweise kleinerer) Dimensionen. Sie besagt im Sinne des Gradientenvolumen-Konzeptes, dass bei der Methodenübertragung das Verhältnis aus Gradientvolumen VG zu Säulenvolumen VC stets konstant gehalten werden muss. Das Säulenvolumen berechnet sich entsprechend aus den Säulendimension (innerer Durchmesser di und der Länge L).

Unter Einhaltung dieser Regeln lassen sich Gradientenmethoden beschleunigen und auf effizientere Säulen übertragen, ohne dass sich die Auflösung der Peaks und das Muster des Chromatogrammes wesentlich verändern.

Eine wichtige Voraussetzung ist dabei das Vorhandensein einer Säule mit anderen Dimensionen, aber äquivalentem Packungsmaterial. Hier können die jeweiligen Säulenhersteller Hilfestellung leisten.

In Abbildung 1 sind die Regeln aus dem Gradientenvolumen-Konzept nochmals an einem Beispiel illustriert.

Inhalt des Artikels:

Kommentare werden geladen....

Kommentar zu diesem Artikel abgeben
  1. Avatar
    Avatar
    Bearbeitet von am
    Bearbeitet von am
    1. Avatar
      Avatar
      Bearbeitet von am
      Bearbeitet von am

Kommentare werden geladen....

Kommentar melden

Melden Sie diesen Kommentar, wenn dieser nicht den Richtlinien entspricht.

Kommentar Freigeben

Der untenstehende Text wird an den Kommentator gesendet, falls dieser eine Email-hinterlegt hat.

Freigabe entfernen

Der untenstehende Text wird an den Kommentator gesendet, falls dieser eine Email-hinterlegt hat.

copyright

Dieser Beitrag ist urheberrechtlich geschützt. Sie wollen ihn für Ihre Zwecke verwenden? Infos finden Sie unter www.mycontentfactory.de (ID: 44363082 / Chromatographie)