Raman-Spektroskopie

Bakterien mit der Raman-Spektroskopie aufspüren

23.04.2009 | Autor / Redakteur: Susann Meisel*, Stephan Stöckel*, Petra Rösch*, Markus Lankers** und Jürgen Popp*** / Marc Platthaus

Dr. Petra Rösch (Chemiestudium Uni Würzburg mit Promotion 2002) ist seit 2002 wissenschaftliche Mitarbeiterin in der Arbeitsgruppe von Prof. Jürgen Popp an der FSU Jena. Ihr Arbeitsgebiet ist die schwingungsspektroskopische Analyse und Charakterisierung von biologischen, medizinischen und pharmazeutischen Proben.

Lebensmittel können leicht von Bakterien befallen werden und eine Gefahr für die menschliche Gesundheit darstellen. Eine Kontrolle auf diese Kontamination ist daher sehr wichtig. Die Raman-Spektroskopie bietet hier ein einfaches und zugleich empfindliches Verfahren.

Der Nachweis von bakteriellen Kontaminationen in Lebensmitteln wird heute routinemäßig meist mithilfe mikrobiologischer Analyseverfahren oder der Polymerase-Kettenreaktion (PCR; polymerase chain reaction) durchgeführt. Die mikrobiologische Identifizierung basiert auf der Fähigkeit von Bakterien, unterschiedliche Nährstoffangebote zu verarbeiten. Mit selektiven Nährmedien kann diese Fähigkeit getestet werden. Dabei zeigen Indikatoren die An- bzw. Abwesenheit unterschiedlicher chemischer Komponenten in den Medien an. Ist eine Bakterienart in der Lage, einen bestimmten Bestandteil im Kultivierungsmedium zu verarbeiten, so wird dies durch einen Farbumschlag angezeigt. Durch eine geeignete Kombination von Nährmedien können Rückschlüsse auf die entsprechende Bakterienart gezogen werden. Bei der PCR wird die DNA der Bakterien isoliert und genomspezifische Sequenzen vervielfältigt. Durch die komplementäre Fänger-DNA mit einem Marker kann die jeweilige Bakterienart identifiziert werden. Die entsprechenden Nachweisverfahren sind zwar sehr spezifisch, haben aber den Nachteil, dass normalerweise eine Vielzahl von Organismen der gleichen Art für die Identifizierung vorhanden sein muss. Aus diesem Grund wird eine Vorkultivierung der Proben notwendig, die je nach Bakterien-Spezies einige Stunden bis zu einigen Tagen benötigt.

Nachweis mit Raman-Spektroskopie

Die Identifizierung von Bakterien durch die Raman-Spektroskopie verfolgt einen komplett anderen Ansatz. Mit der Raman-Spektroskopie werden charakteristische Schwingungen von Molekülen untersucht.

Jedes Molekül besitzt sein eigenes, ganz spezielles Raman-Spektrum. Diese Spektren sind so aussagekräftig, dass man in diesem Zusammenhang auch von einem optischen Fingerabdruck spricht. Durch die Verwendung einer Mikro-Raman-Apparatur – einer Kombination aus einem Raman-Aufbau und einem Mikroskop – ist es möglich, diese Informationen aus einem räumlichen Bereich im Submikrometerbereich zu erhalten. Dies entspricht der Größe von Bakterien. Daher ist es möglich, Raman-Spektren von einzelnen Bakterienzellen zu messen. In Abbildung 1 ist beispielhaft der Fingerprintbereich eines Raman-Spektrums einer einzelnen Bakterie bei einer Anregungswellenlänge von 532 nm dargestellt. Man erkennt die Raman-Banden der einzelnen Molekülklassen. Vor allem die Raman-Banden von Proteinen (Amid-I, Amid-III und Phenylalanin) und der DNA (Guanin, Adenin und Phosphat) sind sehr prominent.

Weil sich Bakterienarten in der biochemischen Zusammensetzung ihrer Zellen unterscheiden, kann anhand ihrer Raman-Spektren eine Differenzierung der Bakterienarten vorgenommen werden. Der große Vorteil dieser Metode ist, dass einzelne Bakterien gemessen werden. Daher fällt ein Anreicherungschritt wie beispielsweise bei den mikrobiologischen Techniken weg, was zu einer erheblichen Zeitersparnis führt.

Bakterien in Milch

Beispielhaft wird der Einsatz der Raman-Spektroskopie anhand von Bakterien-Kontaminationen in Milch gezeigt. Unterschiedliche Inhaltsstoffe wie Kalziumkarbonat, Milchproteine, Stärke, Milchfett oder Laktose können eindeutig über ihre Spektren unterschieden werden. Da manche dieser Milchbestandteile auch in Bakterien vorkommen, musste eine Möglichkeit gefunden werden, die Bakterien von Rückständen der Milch zu trennen. Im linken Bild von Abbildung 2 ist die Mikroskopaufnahme einer kontaminierten Milchprobe dargestellt. Die Lokalisierung von Bakterien ist hier schwierig, da auch Proteinagglomerationen oder Fetttröpfchen Partikel mit ähnlicher Form und Größe bilden. Eine Möglichkeit, Bakterien in einer solchen Matrix sichtbar zu machen, ist die Fluoreszenzfärbung. Hier werden Farbstoffe verwendet, die sich selektiv z.B. an die Bakterien anlagern. Durch eine solche Färbung werden ausschließlich Zellen angefärbt, abiotische Partikel bleiben dagegen unverändert. Im rechten Mikroskopbild in Abbildung 2 ist die Fluoreszenz-Aufnahme des gleichen Ausschnitts dargestellt. Bakterien leuchten hier grün (mit Kreisen markiert). Die gleichen Partikel wurden auch in der Hellfeldaufnahme markiert. Man erkennt, dass allein aufgrund der Morphologie eine Unterscheidung nicht möglich gewesen wäre. Zusätzlich zu einer reinen Lokalisierung wäre auch eine Unterscheidung von lebenden und toten Bakterien möglich. Bei dieser Färbetechnik werden zwei Fluoreszenzfarbstoffe verwendet. Ein Farbstoff färbt nur lebende und der andere ausschließlich tote Bakterien. Allerdings hat die Fluoreszenzmarkierung von Bakterien auch einen Nachteil: Raman-Spektren sind extrem empfindlich gegenüber Fluoreszenz, da diese um mehrere Größenordnungen intensiver ist als die Raman-Intensität und sie so überdeckt. Um bei Fluoreszenz-markierten Bakterien unbeeinflusste Raman-Spektren zu erhalten, müssen einige Bedingungen eingehalten werden: Die Raman-Anregungswellenlänge muss in Spektralbereiche außerhalb der Fluoreszenz-Absorption verschoben werden oder umgekehrt.

Nachweis mit Raman-Spektroskopie

In Abbildung 3 sind beispielhaft die Raman-Spektren von Bacillus-sphaericus- sowie Bacillus-thuringiensis-Sporen dargestellt. Dabei werden die Raman-Spektren der nativen Sporen mit denen aus Milch bzw. Milchfett verglichen. Auf den ersten Blick sind die jeweiligen Raman-Spektren der Sporen kaum zu unterscheiden, der Unterschied zum reinen Milch-Spektrum ist jedoch offensichtlich. Um die Spektren besser vergleichen zu können, wird eine Ähnlichkeitsrechnung durchgeführt. Auf der rechten Seite in Abbildung 3 ist ein Dendrogramm einer hierarchischen Clusteranalyse der Raman-Spektren dargestellt. Die einzelnen Spektren werden als horizontale Striche dargestellt, die je nach ihrer Ähnlichkeit an einer unterschiedlichen Position durch vertikale Striche miteinander verbunden werden. Das Abstandsmaß der Ähnlichkeit ist die Heterogenität.

Je unähnlicher sich zwei Raman-Spektren sind, desto größer ist das Heterogenitätsmaß. Im Dendrogramm wird der unähnlichste Cluster den Milch-Spektren zugeordnet und deutlich von den Spektren der Bakterien abgegrenzt. Der große Cluster der Bakterien-Spektren teilt sich eindeutig in zwei unabhängige Raman-Spektren-Cluster von B. thuringiensis und B. sphaericus auf. Innerhalb dieser Cluster ist allerdings keine Unterscheidung mehr nach nativen oder aus Milch isolierten Endosporen möglich. Offensichtlich ist es möglich, einzelne Bakterien ohne die Notwendigkeit der Kultivierung mittels Mikro-Raman-Spektroskopie zu klassifizieren.

Automatisierte Identifizierung

Für eine Identifizierung unbekannter Bakterien in Lebensmitteln wie Milch muss eine wesentlich umfangreichere Datenbank erarbeitet werden. Daher wurde ein automatisierter Mikro-Raman-Aufbau entwickelt, der es ermöglicht, große Bakterienzahlen in kurzer Zeit zu analysieren (s. Abb. 4). Mit diesem Gerät wird es möglich sein, eine entsprechende Raman-spektroskopische Datenbank für unterschiedliche Lebensmittelmatrices zu erstellen, die eine Identifizierung von bakteriellen Kontaminationen ohne die Notwendigkeit einer Vorkultivierung erlaubt.

*S. Meisel, S. Stöckel, P. Rösch, Institut für Physikalische Chemie, Friedrich-Schiller-Universität Jena, 07743 Jena

**M. Lankers, rap.ID Particle Systems GmbH, 12555 Berlin

***J. Popp, Institut für Photonische Technologien e.V. Jena (IPHT), 07745 Jena

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