ESR und Antioxidantien

Antioxidantien in Lebensmitteln verfolgen

11.06.2008 | Autor / Redakteur: Sascha Rohn*, Bettina Cämmerer* und Lothar W. Kroh* / Marc Platthaus

1 Zitrusfrüchten wird ein hoher Gehalt an Antioxidantien nachgesagt.

Die Bestimmung antioxidativer Eigenschaften von Lebensmitteln stellt eine echte Herausforderung für die Lebensmittelanalytik dar. Mit der Elektronenresonanzspektroskopie (ESR) lässt sich die Wirkung von Antioxidantien direkt im biologischen System oder im Lebensmittel nachweisen und quantifizieren.

Eine Vielzahl analytischer Methoden sind beschrieben, die versuchen, Antioxidantien in Lebensmitteln nachzuweisen. Jedoch korrelieren die Ergebnisse dieser Methoden häufig nur schlecht miteinander und können die tatsächliche antioxidative Kapazität kaum wirklich beschreiben. Verantwortlich dafür sind die unterschiedlichen chemischen Mechanismen und Nachweismethoden, die für die Bestimmung der antioxidativen Wirksamkeit von Substanzen herangezogen werden [1-4]. Zu den am häufigsten zur Charakterisierung primärer Antioxidantien verwendeten Methoden gehören der DPPH-Assay, der TEAC-Test (trolox equivalent antioxidant capacity), der ORAC-Assay (oxygen radical absorbing capacity), TRAP (total radical trapping antioxidant parameter) oder Crocin Bleaching. Die Quantifizierung beruht dabei auf photometrischen Messungen. Das hat den Nachteil, dass stark gefärbte oder trübe Lösungen, wie sie für biologische Proben eher typisch sind, nur schlecht oder gar nicht vermessen werden können bzw. erst nach einer aufwändigen Aufarbeitung der Proben.

ESR-Spektroskopie misst direkt

Anders verhält es sich bei der Elektroneneresonanzspektroskopie (ESR-Spektroskopie). Diese basiert auf der Absorption von Mikrowellenstrahlung durch ungepaarte Elektronen, die aufgrund ihres Eigendrehimpulses (Spin) ein magnetisches Moment besitzen. In einem von außen angelegten Magnetfeld bestehen zwei Möglichkeiten der Spinorientierung, die durch parallele (Grundzustand) bzw. antiparallele Einstellung (angeregter Zustand) im äußeren Magnetfeld gekennzeichnet sind. Die notwendige Energie, die den Übergang von Grund- in angeregten Zustand ermöglicht, hängt linear von der äußeren Magnetfeldstärke ab (s. Abb. 2). Zur Messung wird in der Regel die eingestrahlte Mikrowellenfrequenz konstant gehalten und die Magnetfeldstärke kontinuierlich verändert. Erst wenn die Resonanzbedingung erfüllt ist, d.h. wenn bei einer bestimmten Magnetfeldstärke die eingestrahlte Mikrowellenenergie der Energiedifferenz zwischen Grund- und angeregtem Zustand entspricht, absorbiert das System Energie. Dies ist im Spektrum als Signal zu erkennen.

Mit der ESR-Spektroskopie lassen sich sowohl Lösungen und Suspensionen als auch Feststoffe messen. Als Probengefäße werden, je nach Probenart (fest oder flüssig), Konzentration der paramagnetischen Spezies und Wassergehalt der Probe, Röhrchen oder Kapillaren aus reinem Quarzglas mit unterschiedlichem Innendurchmesser verwendet. Um eine höhere Auflösung zu erreichen, können Gewebe und Zellkulturen in flachen Zellen vermessen werden [5].

Spin-Trapping freier Radikale

Aufgrund ihrer hohen Reaktivität und der damit geringen Stationärkonzentration entziehen sich freie Radikale meist einer direkten Messung. Durch Reaktion mit so genannten Spin-Traps können sie jedoch stabilisiert und dank der so deutlich erhöhten Halbwertszeit mit der ESR-Spektroskopie gemessen werden. Spezifische spin-traps (z.B. DMPO, s. Glossar und Abb. 6) addieren Radikale an Doppelbindungen und bilden Addukte, die aufgrund des Signalmusters die Identifikation der „eingefangenen“ Radikale erlauben. Beim Einsatz von unspezifischen Spin-Traps (z.B. Tempone-H, Abb. 6) kann bei geringerer Einsatzkonzentration eine deutlich höhere Empfindlichkeit erreicht werden [5, 6]. Die Quantität der radikalischen Spezies wird durch Integration der Flächen unter den ESR-Signalen ermittelt. Die verschiedenen ESR-Signalmuster ergeben sich durch Aufspaltung des Elektronenspins in unterschiedliche Energielevel (z.B. Stickstoffradikale: +1, 0 und -1) und Wechselwirkungen des ungepaarten Elektrons mit dem Kernspin von Atomen in der unmittelbaren Umgebung. Benachbarte Atome mit gerader Anzahl von Protonen und Neutronen führen zu keiner Aufspaltung, Atome mit ungerader Anzahl von Protonen und Neutronen bedingen hingegen aufgrund ihrer Kernspinzustände eine Duplettaufspaltung des Signals (z.B. 1H: +½ und -½).

Oxidative Stabilität und Lag-Time

Bei der Lagerung vieler Lebensmittel ist die Oxidation der enthaltenen Lipide die hauptsächliche Ursache für den Fettverderb oder den oxidativen Abbau von Aromastoffen. Diese bilden dann unerwünschte Geruchs- und Geschmacksnoten sowie potenziell toxische Abbauprodukte und sind deshalb nicht mehr zum Verzehr geeignet. Daher ist eine verlässliche Methode zur Vorhersage der Lagerstabilität von besonderer Bedeutung. Mit konventionellen Methoden wie der TBARS (Thiobarbitursäurezahl) kann nur die Bildung sekundärer Oxidationsprodukte in der Finalphase des Fettverderbs nachgewiesen werden. Um jedoch die Kapazität der endogenen Antioxidantien bewerten und damit die mögliche Lagerzeit vorhersagen zu können, müssen bereits die in der Startphase der Autoxidation gebildeten Radikale detektiert werden. Die Bildung freier Radikale ist durch die ESR-Spektroskopie gut nachweisbar und korreliert mit der oxidativen Stabilität fetthaltiger Lebensmittel. Das ist in der Literatur beschrieben [7, 8]. Über so genannte Lag-Time-Messungen durch ESR-Spin-Trapping kann der Zeitpunkt, zu dem die endogenen Antioxidantien verbraucht sind und der Verderb durch Fettoxidation beginnt, genau bestimmt werden – und dies lange bevor sensorische Veränderungen auftreten. Diese Methode wurde erstmals angewandt, um die oxidative Stabilität von Bier zu beurteilen [9].

Bekannt ist auch, dass durch Röstung die Oxidationsstabilität von Nüssen abnimmt. Das hat zwei Gründe: Die Rösttemperatur führt zum Abbau endogener Antioxidanzien (z.B. Tocopherol). Außerdem platzen die Fettzellen auf und Sauerstoff kann eindringen. Das ist besonders für Lebensmittel wie Müslimischungen von Bedeutung, die normalerweise lange haltbar sind. Durch den Zusatz gerösteter Nüsse kann sich dann schnell ein ranziger off-flavor entwickeln. Abbildung 3 zeigt am Beispiel verschieden gerösteter Erdnüsse, wie mittels Lag-Time-Untersuchungen die Lagerstabilität der Proben bestimmt werden kann. Unter den hier gewählten Bedingungen sind die stark gerösteten Erdnüsse (braune Linie) stabiler als die schwach gerösteten (gelbe Linie), was durch eine längere Lag-Time angezeigt wird. Der Grund dafür ist, dass die Röstung ebenso die Bildung antioxidativ wirksamer Maillardreaktionsprodukte, Melanoidine und Reduktone, anregt. Diese können den „Verlust“ an nativen Antioxidantien kompensieren. Mithilfe solcher Untersuchungen lassen sich beispielsweise verfahrenstechnische Bedingungen der Röstung oder Lagerung von Lebensmitteln verfolgen und teilweise optimieren.

ESR mit stabilisierten Radikalen

Antioxidative Eigenschaften von Lebensmittelinhaltstoffen lassen sich ESR-spektroskopisch qualitativ und quantitativ mihilfe von stabilisierten Radikalen bestimmen (s. Glossar und Abb. 6). In diesem Fall werden stabilisierte Radikale vorgelegt und deren Abbau durch Antioxidantien (Übertragung eines Elektrons und eines Protons) ESR-spektroskopisch verfolgt. Das Reaktionsprodukt ist ESR-inaktiv und damit nimmt das ESR-Signal ab. Die zeitabhängige Abreaktion des Radikals ist von zwei Faktoren abhängig: von der Konzentration des vorgelegten stabilisierten Radikals und von der Konzentration und dem antioxidativen Wirkmechanismus der zu untersuchenden Substanz. Sollen die antioxidativen Eigenschaften verschiedener Substanzen verglichen werden, können diverse Parameter berechnet werden, z.B. das antioxidative Potenzial, die antioxidative Aktivität oder die antioxidative Kapazität aus der Kinetik des Radikalabbaus [5, 6]. In Abbildung 4 sind zwei Beispielkurven für den Abbau eines stabilisierten Radikals in Weinproben dargestellt.

Die ESR-Messung mit stabilisierten Radikalen eignet sich besonders gut für den Nachweis anti- und/oder prooxidativer Eigenschaften von Lebensmitteln oder speziellen Lebensmittelinhaltsstoffen wie Vitaminen (A, C, E), Polyphenolen und anderen sekundären Pflanzenstoffen. Gleichzeitig können damit Veränderungen der antioxidativ wirksamen Strukturen durch Verarbeitungsprozesse verfolgt werden. Welche Verbindungen die antioxidative Eigenschaft verursachen, wurde exemplarisch am Beispiel von Sanddorn untersucht. Der Saft konnte chromatographisch an Sephadex LH 20 in einzelne Fraktionen aufgetrennt, auf seine Inhaltsstoffe untersucht und deren antioxidative Kapazität mit Fremy’s Salz bestimmt werden [11]. Abbildung 5 zeigt, dass die verschieden glycosidierten Flavonole nur einen relativ geringen Beitrag zur antioxidativen Aktivität des Saftes liefern. Viel bedeutender sind die im Sanddorn reichlich vorkommenden Procyanidine, insbesondere die oligomeren Verbindungen, die eine ausgesprochen hohe antioxidative Kapazität besitzen [12]. Vergleichbare Verbindungen kennt man auch aus grünem Tee, dessen günstige ernährungsphysiologische Wirkung heute unumstritten ist und ebenfalls mit Procyanidinen in Verbindung gebracht wird.

Eine weitere Möglichkeit für Untersuchungen zur antioxidativen Aktivität von Lebensmitteln ist der Einsatz verschiedener stabilisierter Radikale. Während Fremy’s Salz nahezu alle bekannten endogenen Antioxidantien detektiert, spricht z.B. TEMPO nicht auf phenolische Strukturen an. Auf diese Weise konnte in grünen Kaffeebohnen, in Röstkaffee sowie daraus hergestelltem Kaffeegetränk die Verschiebung des Anteils der antioxidativen Verbindungen nachgewiesen werden. Während in grünem Kaffee als Hauptkomponente Polyphenole ermittelt wurden, konnten in geröstetem Kaffee und dem Kaffeegetränk die durch Röstung gebildeten Melanoidine nachgewiesen werden [13].

Fazit

Die Beispiele zeigen, dass die ESR-Spek-troskopie mit ihren zwei grundlegenden methodischen Ansätzen (Spin-Trap und stabilisierte Radikale) in der Lage ist, wichtige Informationen zu funktionellen Eigenschaften von Lebensmitteln zu liefern, wie etwa deren antioxidative Aktivität. Kombiniert mit der Trennung und Strukturaufklärung chemischer Verbindungen erhöht dies die Informationsdichte über bioaktive Inhaltsstoffe und komplex aufgebaute Lebensmittel. Im Sinne einer gesunden Ernährung könnte das gartenbauliche und technologische Prozesse beeinflussen oder steuern.

Hintergrund: Mini-Glossar der Antioxidantien:

Spin-Trap: organische Verbindung, die mit einem Radikal ein stabilisiertes Spin-Trap-Addukt-Radikal bildet (Bsp. s. Abb. 6).

Lag-Time: Zeitpunkt, zu dem die antioxidative Kapazität der Probe erschöpft ist und ab dem sich kontinuierlich Spin-Trap-Addukte bilden.

Stabilisiertes Radikal: stabiles synthetisches Radikal, das zum Nachweis von antioxidativen Eigenschaften genutzt wird (Bsp. s. Abb. 6).

Antioxidatives Potenzial: Maß für die Geschwindigkeit des Abbaus des vorgelegten Radikals [µM abgebautes Radikal/min].

Antioxidative Kapazität: Maß für die Konzentration des Radikals, die nach x Minuten durch eine definierte Menge eines spezifischen Antioxidanses abgebaut wird [µM abgebautes Radikal/µM Antioxidans].

Antioxidative Aktivität: Menge an Radikal, die nach x Minuten durch eine definierte Menge der Probe abgebaut wird. Wird genutzt, wenn z.B. Antioxidantien in Lebensmitteln bestimmt werden, deren Art und Menge nicht genau festgelegt werden kann.

Literatur:

[1] Antolovich M, Prenzler PD, Patsalides E, McDonald S, Robards K; Methods for testing antioxidant activity. Analyst 2002; 127: 183–198

[2] Böhm V, Schlesier K, Methods to evaluate the antioxidant activity. Production, Practices and Quality Assessment of Food crops, vol.3 „Quality handling and evaluation“ Eds. R. Dris, S. M. Jain, Kluwer Academic Publishers 2004, pp 55-71

[3] Frankel EN, Meyer AS, The problem of using one-dimensional methods to evaluate multifunctional food and biological antioxidants. Journal of the Science of Food and Agriculture 2000; 80: 1925-1941

[4] Huang D, Ou B, Prior LR, The chemistry behind antioxidant capacity assays. Journal of Agricultural and Food Chemistry 2005; 53: 1841-1856

[5] Müller J, Rösch D, Kroh LW, Elektronenspinresonanz-Spektroskopie (ESR). Schnellmethoden zur Beurteilung von Lebensmitteln und ihren Rohstoffen. Eds W. Baltes, L. W. Kroh, Behr’s Verlag GmbH Co KG, Hamburg, 3. Auflage 2004, pp 251-271

[6] Rohn S, Kroh LW, Electron Spin Resonance – A spectroscopic method for determining the antioxidative activity. Molecular Nutrition & Food Research 2005; 49: 898-907

[7] Kristensen D, Skibsted LH, Comparison of Three Methods Based on Electron Spin Resonance Spectrometry for Evaluation of Oxidative Stability of Processed Cheese. Journal of Agricultural and Food Chemistry 1999; 47: 3099-3104

[8] Thomsen M K, Kristensen D, Skibsted L H, Electron spin resonance spectroscopy for determination of the oxidative stability of food lipids. Journal of the American Oil Chemists‘ Society 2000; 77: 725-730

[9] Uchida M, Suga S, Ono M, Improvement for oxidative Flavor stability of beer-rapid prediction method for beer flavor stability by electron spin resonance spectroscopy. The Journal of the American Society of Brewing Chemists 1996; 54: 205-211

[10] Rodarte A, Eichholz I, Rohn S, Kroh LW, Huyskens-Keil S, Phenolic Profile and Antioxidant Activity of Highbush Blueberry (Vaccinium corymbosum L.) during Fruit Maturation and Ripening. Food Chemistry 2008; 109: 554-563

[11] Rösch D, Bergmann M, Knorr D, Kroh LW, Structure-antioxidant efficiency relationships of phenolic compounds and their contribution to the antioxidative activity of sea buckthorn juice. Journal of Agricultural and Food Chemistry 2003; 51: 4233-4239.

[12] Rösch D, Krumbein A, Kroh LW, Antioxidant gallocatechins, dimeric and trimeric proanthocyanidins from sea buckthorn (Hippophae rhamnoides) pomace. European Food Research and Technology 2004; 219: 605-613.

[13] Cämmerer B, Kroh LW, Antioxidant activity of coffee brews. European Food Research and Technology 2006; 223: 469-474

*Dr. S. Rohn, Dr. B. Cämmerer, Prof. Dr. L. W. Kroh, Institut für Lebensmitteltechnologie und Lebensmittelchemie der Technischen Universität Berlin, 13355 Berlin

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