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Pragmatischer UHPLC

So steigern Sie die Produktivität Ihrer UHPLC

| Autor / Redakteur: Frank Steiner* / Dr. Ilka Ottleben

Durch die Optimierung einiger Analyse-Parameter kann die Produktivität einer UHPLC-Anlage gesteigert werden.
Durch die Optimierung einiger Analyse-Parameter kann die Produktivität einer UHPLC-Anlage gesteigert werden. (Bild: Thermo Fisher Scientific)

In Zeiten ständig steigender Probenaufkommen können Methoden, welche die Analysenzeit reduzieren – wie die UHPLC – einen entscheidenden Beitrag zur Wirtschaftlichkeit von Laboren leisten. Doch wie lässt sich das Potenzial der UHPLC in pragmatischer Weise optimal nutzen?

Die Flüssigchromatographie hat in den letzten zehn Jahren entscheidende Fortschritte im Leistungspotenzial gemacht. Sowohl Säulen, als auch Gerätetechnologie erlauben eine erhebliche Leistungssteigerung, besonders in der Analysengeschwindigkeit. Die Fortschritte kommen jedoch nicht in allen Labors an. Ursache ist nicht ein Investitionsstau in neue Geräte und Säulen, sondern andere Hürden. So ist beispielsweise eine Softwareassistenz zur Übertragung von Methoden teilweise vorhanden, aber nur bedingt anwendbar. Trainingsangebote von Herstellern zielen oft nur auf die optimale Bedienung ihrer Produkte, nicht aber auf fundamentales Verständnis der Grundlagen.

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Auch die Regulierung der Labors (besonders in der QC der Pharmaindustrie) ist eine weitere Hürde. Daher wird der Weg von HPLC zu UHPLC oft als sehr aufwändig oder unmöglich empfunden.

Was ist eigentlich UHPLC?

Die Frage nach der Definition von UHPLC beziehungsweise ihre Abgrenzung zur HPLC wird von Herstellern in nicht uneigennütziger Weise immer wieder gestellt. Sachlich objektiv betrachtet: Es geht grundsätzlich um Leistungssteigerung in der Flüssigchromatographie unter Verwendung von Säulen mit kleineren Partikeln in optimierten Apparaturen, welche höhere Arbeitsdrücke erlauben und die verlustfreie Anwendung der entsprechenden Säulen unterstützen. Die Abgrenzung ist nicht klar definiert, die Festlegung ist aber für keinen Anwender von Nutzen.

Solides Grundlagenwissen ist hingegen unerlässlich für die erfolgreiche Implementierung leistungsstarker UHPLC-Methoden. Faustregeln sind hilfreich in der Praxis, aber sollten stets durch fundamentales Verständnis untermauert sein.

Dieser Leitartikel soll die Potenziale der UHPLC einschließlich der Anwendung höherer Betriebstemperatur der Säulen kritisch beleuchten. Auch das Verständnis aller instrumentellen Voraussetzungen ist dabei wichtig.

Kriterien der UHPLC-Optimierung

Der Anwendernutzen lässt sich im wesentlichen durch Laborproduktivität, Kosteneffizienz und Qualität der Analysen charakterisieren. Die erstgenannten sind in Leistungsindikatoren wie Zeit pro Analyse und Kosten pro Analyse reflektiert, die Qualität ist in der Ausprägung von Validierungsparametern (Selektivität, Genauigkeit, Wiederfindung, Linearität, Nachweis- und Bestimmungsgrenzen, etc.) zu erkennen. Dabei resultieren einige Vorteile (Präzision als Bestandteil der Genauigkeit, Linearität und Nachweisstärke der Detektion) größtenteils direkt aus Weiterentwicklungen der Geräte. Es herrscht im Gegenzug oft Skepsis bezüglich der Präzision und Robustheit von UHPLC-Methoden. Diese ist meist unbegründet, schlechte Erfahrungen oftmals durch Unwissen und falsche Erwartungen der Anwender bedingt, also Anwendung ungeeigenter Methoden, Injektion ungeeignet vorbereiteter Proben oder Bedienungsfehler. Zu kurze Standzeit von Säulen im Betrieb unter manchmal extremen Bedingungen von Druck, Fluss oder Temperatur wird oft kritisiert, hier muss aber immer die maximale Anzahl von Analysen pro Säule gesehen werden, nicht in welcher Frequenz eine Säule getauscht wird.

Wichtige Grundlagen

Kinetische Optimierung in der Flüssigchromatographie kann mittels H/u-Kurven (van-Deemter-Kurven) systematisch diskutiert werden. Bodenhöhe H ist Maß für Bandenverbreiterung in der Säule, ein großes H ist schlecht, es reduziert Auflösung. Die Linerargeschwindigkeit u ist ein direktes Maß für die Analysengeschwindigkeit. Die Kurven (s. Abb. 1a) zeigen mit Pfeilmarkierung die Geschwindigkeit für optimale Auflösung (Minimum). An der Steigung des rechten Astes erkennt man den Preis der bei höherer Analysengeschwindigkeit als Bandenverbreiterung und Auflösungsverlust zu zahlen ist. Dieser ist bei unterschiedlichen dp sehr verschieden. Die Beiträge der drei Terme A, B und C zur Kurve in Form des Diffusionskoeffizienten des Analyten in der mobilen Phase Dm und des Teilchendurchmessers dp der stationären Phase sind in Gleichung 1 zu erkennen (λ, γ, ω sind weitere Säulen- oder Methodenparameter). Die Formel zeigt am Ende auch eine vereinfachte Abschätzung aller drei Terme (abhängig von dp), die für die Trennung kleiner Moleküle bei Raumtemperatur in der RP-Chromatographie recht universell gilt. Die Formel soll vor allem die Grundlage für die korrekte relative Änderung der Parameter bei Geschwindigkeitsoptimierung liefern. Teilchendurchmesser dp wirkt sich sowohl im A-Term als auch im C-Term, im C-Term sogar quadratisch aus.

Glg.1
Glg.1 (Bild: Thermo Fisher Scientific)

Aus Gleichung 1 ergibt sich durch Ableitung nach u und Nullsetzen dieser die folgende wichtige Gleichung bzw. Abschätzung für das Minimum:

Glg.2
Glg.2 (Bild: Thermo Fisher Scientific)

Aus dem Vergleich der H/u-Kurven bei verschiedenen Teilchendurchmessern zusammen mit der Kenntnis, dass Bodenzahl N ein Maß für die Trennleistung ist und sich aus dem Quotienten von Säulenlänge L und Bodenhöhe H ergibt (N=L/H) leiten sich drei Konsequenzen ab:

  • H-Wert im Minimum der H/u-Kurve ist zum Teilchendurchmesser dp proportional, also lässt sich durch eine Halbierung von dp bei Anpassung von u die Trennleistung (Bodenzahl N) verdoppeln.
  • Die optimale Lineargeschwindigkeit uopt (Lage des Minimums auf der x-Achse, beschrieben in Gleichung 2) verschiebt sich umgekehrt proportional zu dp. Somit ist bei Halbieren von dp zum Erreichen der optimalen Trennleistung auch die doppelte Lineargeschwindigkeit notwendig. Damit ist bei gleicher Säulenlänge nicht nur die Trennleistung verdoppelt, sondern die Methode wird automatisch doppelt so schnell.
  • Die Steigung des C-Terms (proportional zu dp²) nimmt mit kleiner werdendem dp stark ab. Nach Halbierung des Teilchendurchmessers führt z.B. eine Verdoppelung von u über das Minimum der Kurve hinaus lediglich zu ¼ der Einbuße in der Trennleistung im Vergleich zu dem originalen Teilchendurchmesser. Wesentlich weniger Nachteil bei Steigerung der Geschwindigkeit.

Mit Glg. 2 lässt sich z.B. berechnen, dass die per Faustregel geltende optimale Lineargeschwindigkeit für 5 µm Säulen bei 2 mm/s liegen sollte. Weiterer Schluss ergibt sich durch Einsetzen von uopt aus Glg. 2 in Glg. 1 und liefert den H-Wert im Kurveminimum für einen bestimmten Teilchendurchmesser dp:

Glg.3
Glg.3 (Bild: Thermo Fisher Scientific)

H-Wert einer optimal betriebenen Säule sollte nicht größer sein als das dreifache des Teilchendurchmessers der stationären Phase, bei modernen Säulen eher besser. Diese Erkenntnis erlaubt Rückschlüsse auf die verwendete Apparatur. Ist das bei Retentionsfaktor k ≥ 2 der Fall, so muss davon ausgegangen werden, dass mit der Säule etwas nicht in Ordnung ist, sie weit entfernt von uopt betrieben wird, oder die verwendete Apparatur nicht zum Betreiben der Säule geeignet ist.

Folgende Defizite sind bei einer Apparatur möglich:

  • Verbindungskapillaren sind ungeeignet (zu großer Durchmesser).
  • Fluidische Verbindungen weisen Totvolumina auf.
  • Injiziertes Probenvolumen ist zu groß oder Dispersion in Autosampler-Fluidik unangemessen.
  • Die Detektorzelle hat ein zu großes Volumen.
  • Am Detektor ist eine zu große Zeitkonstante eingestellt.

Bezüglich fluidischer Verbindungen zeigen die Thermo Scientific Viper Kapillaren mit stirnseitiger Dichtung Vorteile. Sie sind automatisch nahezu frei von Totvolumen, sobald sie per Hand dicht angezogen wurden. Das Design und Funktionsprinzip ist in Abbildung 2 gezeigt. Ebenso sieht man dort den Effekt, wie schlechte fluidische Verbindungen das Erkennen eines Schulterpeaks unmöglich machen.

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