Richtig Pipettieren Acht Voraussetzungen für die korrekte Kalibrierung von Kolbenhubpipetten

In Teil 1 unserer Artikelserie haben wir Ihnen Tipps zur korrekten Handhabung von Pipetten gegeben – wichtige Grundvoraussetzung. Doch Kolbenhubpipetten unter­liegen im Laboralltag zahlreichen Einflüssen und müssen, um exakt zu arbeiten, regelmäßig kalibriert werden. Worauf kommt es dabei an? Das erfahren Sie nun im Teil 2: Exakte Kalibrierung von Kolbenhubpipetten

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Dr. Klinkner & Partner GmbH Kalibrierlabor

Im Laboralltag verändern sich Kolbenhubpipetten, wie andere Messgeräte auch, durch Verschleiß oder Verschmutzungen. Damit sichergestellt ist, dass sie als Präzisionsmessinstrumente weiter exakt arbeiten, müssen sie regelmäßig kalibriert werden.

Dabei werden zwei Messgrößen bestimmt:

• die Unrichtigkeit (systematische Abweichung, oft auch als Richtigkeit bezeichnet) aus der Differenz des Mittelwertes dieser Messreihe und dem Soll-Wert, also dem an der Pipette eingestellten zu dosierenden Volumen und

• die Unpräzision (zufällige Abweichung, oft auch als Präzision bezeichnet) in Form der Standardabweichung einer Messreihe mit zehn Messwerten.

Durch Kombination der zufälligen und systematischen Abweichungen lässt sich auch die Messunsicherheit ermitteln, die für akkreditierte Labore eine Schlüsselgröße ist. Sind sowohl Unrichtigkeit als auch Unpräzision klein, kann das Messergebnis als genau bezeichnet werden.

Kolbenhubpipetten richtig kalibrieren – aber wie?

Kalibrierungen müssen immer mit höchstmöglicher Genauigkeit durchgeführt werden, damit nicht Ungenauigkeiten im Kalibriervorgang ungenaue Messgeräte vortäuschen. Die erste Grundvoraussetzung dafür ist die korrekte Handhabung der Pipetten durch den Nutzer.

Richtig Pipettieren

Zehn Fehler beim Pipettieren und wie man sie verhindert

Die zweite Grundvoraussetzung sind eine geeignete messtechnische Ausstattung und geeignete Umgebungsbedingungen. Der aktuelle Stand der Technik dazu ist in zwei zu beachtenden Dokumenten im Detail beschrieben:

• die DIN EN ISO 8655 – Volumenmessgeräte mit Hubkolben: Sie besteht aus mehreren Teilen, wobei Teil 2 (DIN EN ISO 8655-2 Kolbenhubpipetten) und Teil 6 (DIN EN ISO 8655-6: Gravimetrische Prüfverfahren zur Bestimmung der Messabweichung für Pipetten) für Kolbenhubpipetten relevant sind. Erhältlich sind diese international harmonisierten Normen kostenpflichtig über den Beuth-Verlag.

• die vom Deutschen Kalibrierdienst (DKD) herausgegebene nationale Richtlinie DKD-R 8-1 Kalibrierung von Kolbenhubpipetten. Sie kann vom Server der PTB in Braunschweig kostenlos heruntergeladen werden.

Wir befassen uns an dieser Stelle mit dem weiter verbreiteten und genaueren gravimetrischen Kalibrierverfahren (daneben gibt es auch ein photometrisches Verfahren).

Acht Voraussetzungen für korrekte Kalibrierergebnisse

Im Detail stellen die oben genannten Dokumente folgende Anforderungen an die Messtechnik und die Umgebungsbedingungen bei jeder Kalibrierung:

• Waage: Abhängig vom Nennvolumen der Pipetten und vom Wägebereich der Waagen kann eine Feinwaage, eine Analysenwaage, eine Halbmikrowaage oder eine Mikrowaage erforderlich sein.

• Prüfflüssigkeit: Die zu pipettierende Prüfflüssigkeit muss Wasser der „Qualität 3“ nach ISO 3696 sein, also destilliertes Wasser mit einer Leitfähigkeit <5 µS/cm.

• Lufttemperatur: Die Temperatur des Prüfraumes muss zwischen 15 °C und 30 °C liegen, konstant sein und darf während einer Kalibrierung um nicht mehr als 0,5 °C schwanken.

• Temperatur der Prüfflüssigkeit: Die Wassertemperatur darf maximal 0,5 °C von der Temperatur der Umgebungsluft abweichen.

• Verdunstung: Verdunstungsverluste während des Kalibrierens müssen erfasst und berücksichtigt oder durch eine Verdunstungsfalle (s. Abb. 3) auf ein vernachlässigbares Maß reduziert werden.

• Luftfeuchte: Die Luftfeuchtigkeit muss mit einem Hygrometer gemessen werden und nach ISO 8655 >50% sein. Die neuere DKD-R 8-1 schreibt eine Luftfeuchtigkeit von 45% bis 60% vor.

• Luftdruck: Er muss gemessen und angegeben werden.

• Äquilibration: Die zu prüfenden Pipetten, die Pipettenspitzen und das verwendete Wasser müssen vor der Kalibrierung mindestens zwei Stunden im Prüfraum bei konstanten Klimabedingungen gelagert werden.

• Kalibrierung und Rückführung der Messgeräte: Waagen, Thermometer, Hygrometer und Barometer müssen kalibriert sein. Von der DAkkS für die Kalibrierung akkreditierte Labore müssen die Rückführung der Kalibrierung auf internationale Normale nach­weisen, beispielsweise durch Vorlage von DAkkS-Kalibrierscheinen.

Da beim gravimetrischen Verfahren ein Gewicht bzw. eine Masse gemessen wird, muss über die Dichte in das Volumen umgerechnet werden. Alle Eingangsgrößen werden dazu in eine Formel gepackt und damit der so genannte Z-Faktor ermittelt, mit dem dann sehr einfach Gewicht bzw. Masse des pipettierten Wassers in das pipettierte Volumen umgerechnet werden kann. Der Z-Faktor muss aber nicht zwangsläufig berechnet werden, er ist als tabellarischer Anhang in der ISO 8655 enthalten.

Durchführung der Pipetten-Kalibrierung

Bei der Kalibrierung einer Kolbenhubpipette mit fixem Volumen werden zehn Messwerte zügig und ohne Unterbrechung in einer Messreihe erzeugt. Für ein zuverlässiges Ergebnis sollten Sie Fehler beim Pipettieren vermeiden, z.B. das zu tiefe Eintauchen der Pipettenspitze in die Flüssigkeit.

Bei Kolbenhubpipetten mit variablem Volumen sind dreimal zehn Messwerte zu pipettieren: zehn Messwerte beim Nennvolumen (das größte auf der Pipette angegebene Volumen), danach zehn Messwerte bei 50% des Nennvolumens und abschließend zehn Messwerte bei 10% des Nennvolumens (oder beim kleinsten auf der Pipette angegebenen Volumen, je nachdem welches das größere ist).

Nur bei sofort erkennbaren Pipettierfehlern (Luft angesaugt, Spitze verrutscht o.ä.) darf ein Wert verworfen werden – und zwar sofort, mit Dokumentation und nicht erst nach Abschluss der Messreihe. Manipulieren durch Selektieren („testing into compliance“) muss ausgeschlossen sein!

Von Unrichtigkeit und Unpräzision

Aus den so erhaltenen Messwerten werden für jedes Volumen zwei wichtige Werte bestimmt – die Unrichtigkeit und die Unpräzision. Doch was sagen uns diese Werte?

Die Unrichtigkeit ist die Abweichung des Mittelwerts der durchgeführten Pipettierungen vom Sollwert. Durch die zehn Messungen gleichen sich die zufälligen (beidseitig streuenden) Messabweichungen statistisch weitgehend aus, sodass nur die durchschnittliche systematische (einseitige) Messabweichung übrig bleibt. Sie sollte idealerweise nahe bei Null sein. Allerdings sollte man auch bei einer neuen Pipette nicht erwarten, dass sie gleich Null ist. Je größer diese Messabweichung ist, desto wahrscheinlicher sind Verschleiß, Verschmutzungen oder Undichtigkeiten als Ursache. Als Gegenmaßnahmen kommen dann Reinigung, Reparatur oder Justierung in Betracht.

Die Unpräzision gibt Auskunft über die Streuung der durchgeführten Pipettierungen. Sie wird deshalb auch als Standardabweichung angegeben unter der Annahme, dass die Messwerte normalverteilt sind. Je weiter die einzelnen Werte auseinander liegen, desto größer ist die Unpräzision. Man unterscheidet zwischen absoluter Unpräzision (in µL oder mL) und relativer Unpräzision (in %): bei abnehmendem Pipettiervolumen nimmt die absolute Unpräzision ab, die relative Unpräzision aber zu (s. Abb. 2 in der Bildergalerie).

Bildergalerie

Anwendungsbeispiel eines Kalibrierergebnisses

Eine 1000-µL-Pipette mit fixem Volumen wird (beim Nennvolumen) kalibriert, der Sollwert ist also 1000 µL. Die Messergebnisse sind in Tabelle 1 in der Bildergalerie dargestellt. Hieraus ergeben sich folgende Kennzahlen:

• Unrichtigkeit (systematische Messabweichung): Mittelwert der pipettierten Volumina: 998,7 µL; Unrichtigkeit (Differenz zum Sollwert): -1,3 µL

• Unpräzision (zufällige Messabweichung): Unpräzision (Standardabweichung der Messreihe): ±1,0 µL Um eine Genauigkeitsaussage auf einem Vertrauensniveau von etwa 95% machen zu können, wird diese Unpräzision mit dem Erweiterungsfaktor k = 2 multipliziert, wobei eine Normalverteilung der Werte angenommen wird.

Das Messergebnis lautet also 998,7 µL ±2,0 µL. Dies bedeutet, dass ein pipettiertes Volumen mit 95%iger Wahrscheinlichkeit zwischen 996,7 µL und 1000,7 µL liegt.

Was fängt man mit diesen Zahlen an?

Noch fehlt ein Kriterium zur Bewertung der Unrichtigkeit von -1,3 µL und der (erweiterten) Unpräzision von 2,0 µL. Für jede Pipette und jedes Volumen gibt es Vorgaben, wie groß die Unrichtigkeit und die Unpräzision sein dürfen – die so genannten Toleranzen. Leider gibt es hier verschiedene Toleranzen, wobei sich jedes Labor für eine Toleranz entscheiden muss (s. ergänzendes zum Thema). Liegen die Unrichtigkeit und Unpräzision bei jedem überprüften Volumen unter den in den Toleranzen erlaubten Werten hat die Pipette die Kalibrierung bestanden.

Bewertet man die Ergebnisse gegen die Normtoleranzen der DIN EN ISO 8655, dann findet sich in der Norm:

• eine Normtoleranz von ±8 µL für die Unrichtigkeit bei 1000 µl Nennvolumen. Die Unrichtigkeit der Messreihe ist mit -1,3 µL also innerhalb der Toleranz.

• eine Normtoleranz von ±3 µL für die Unpräzision bei 1000 µl Nennvolumen. Die Unrichtigkeit der Messreihe ist mit ±1,0 µL also innerhalb der Toleranz.

Die Pipette erfüllt also beide Normtoleranzen oder anders ausgedrückt sie ist „konform“ damit. Ihre Konformitätsprüfung ist demnach bestanden.