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Lebensmittelanalytik

Alternaria-Toxine mit Festphasenextraktion und LC-MS/MS bestimmen

| Autor/ Redakteur: Lilli Reinhold und Iris Bartels* / Marc Platthaus

Schimmelpilze können eine Vielzahl toxischer Stoffwechselprodukte produzieren und so Lebensmittel kontaminieren. Zur Gattung der mykotoxinbildenden Schimmelpilze gehören auch die Alternaria-Arten, über deren Exposition und Toxikologie bisher wenig bekannt war. Eine neue LC-MS/MS Methode erlaubt den qualitativen und quantitativen Nachweis verschiedener Alternaria-Toxine in einer Probe.

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Abb. 1 Mithilfe der Festphasenextraktion und dem hydroxylierten Copolymer Bond-Elut-Plexa als Sorbens wurde das Rohextrakt von Störsubstanzen befreit und konzentriert.
Abb. 1 Mithilfe der Festphasenextraktion und dem hydroxylierten Copolymer Bond-Elut-Plexa als Sorbens wurde das Rohextrakt von Störsubstanzen befreit und konzentriert.
( Archiv: Vogel Business Media )

Lebensmittel pflanzlichen Ursprungs wie Getreide, Obst und Gemüse und deren Verarbeitungsprodukte können von Pilzen befallen werden. Das Lebensmittel verdirbt dadurch und kann gesundheitsschädliche Mykotoxine sowie andere Sekundärmetabolite enthalten. Neben den bekannten Schimmelpilzen der Gattung Penicillium und Aspergillus ist auch die gesundheitliche Belastung der strukturell teilweise noch unbekannten Toxine aus Alternaria-Spezies (Schwärzepilze) von Bedeutung.

Pilze aus dieser äußerst komplexen Gattung treten sehr weit verbreitet auf, u.a. in Hirse, Weizen, Roggen, in Sonnenblumenkernen, Äpfeln, Birnen, Trauben, Tomaten und Kartoffeln. Sie bilden in unterschiedlichem Maße Toxine und sekundäre Stoffwechselprodukte. Alternariol (AOH), ein natürliches Resorcylsäurelacton, konnte in verarbeiteten Produkten wie Apfel- und Traubensaft vereinzelt in erhöhten Mengen gefunden werden. Weitere relevante Toxine sind Alternariolmonomethylether (AME), Altenuen (ALT) und Tenuazonsäure. Bislang sind kaum Untersuchungen zur Exposition und Toxikologie dieser Mykotoxinbildner durchgeführt worden, sodass die Datenlage nicht ausreicht, um eine Risikoabschätzung für den Verbraucher vorzunehmen [1].

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Daher ist es erforderlich, zur Bestimmung der Alternaria-Toxine eine routinetaugliche Multimethode zu entwickeln. In der Vergangenheit basierte die Analytik dieser Toxine in Obst- und Gemüseerzeugnissen auf HPLC, Dünnschichtchromatographie sowie GC/MS nach Silylierung [2,3]. Kürzlich wurde auch ein LC-MS/MS-Nachweis vorgestellt [4]. Die im Folgenden beschriebene Methode erlaubt die Identifikation und Quantifizierung der Alternaria-Toxine Alternariol (AOH), Alternariolmonomethylether (AME), Altenuen (ALT), Tentoxin (TEN) sowie Tenuazonsäure (TEA) in festen und flüssigen Lebensmitteln mithilfe der LC-Tandem-Massenspektrometrie.

Extraktion, Festphasenextraktion und LC-MS/MS – Beschreibung

Im vorliegenden Beispiel werden Lebensmittel wie Gemüse- und Traubensaft untersucht. Nach Extraktion der Probe aus fester und flüssiger Matrix wird der Rohextrakt mit Phosphatpuffer verdünnt, mittels Festphasenextraktion gereinigt und aufkonzentriert. Die zu bestimmenden Analyten werden anschließend mit Methanol/Acetonitril von der Festphase eluiert, zur Trockne eingedampft und in einem definierten Volumen aufgenommen. Der Alternaria-Toxingehalt wird mittels LC-MS/MS bestimmt. Dabei erfolgt die Identifizierung einzelner Toxine anhand der Retentionszeiten und Ionenmassen. Die Quantifizierung wird nach der Methode des externen Standards über die Peakfläche vorgenommen.

Für die Festphasenextraktion wird ein hydroxyliertes Copolymer, Bond-Elut-Plexa (200 mg, 6 mL) von Varian verwendet. Die LC-MS/MS besteht aus einem Waters-2695-HPLC-System mit Micromass-Quattro-Premier und Masslynx-Auswertesoftware. Als HPLC-Säule wird eine Pentafluorphenylphase vom Typ Varian Monochrom-MS (150 x 3 mm, 5 µm), verwendet.

Extraktion, Festphasenextraktion und LC-MS/MS – Durchführung

Für die Extraktion der Alternaria-Toxine aus fester Matrix werden zunächst 20 Gramm der homogenisierten Probe in einem Becherglas eingewogen. Die Probe wird mit 60 mL einer Acetonitril-Methanol-Wasser-Mischung (pH 3, Mischungsverhältnis: 45/10/45) versetzt und mindestens für zwei Minuten mittels Ultra-Turrax homogenisiert. Der Extrakt wird zehn Minuten lang bei 4000 rpm zentrifugiert. 6 mL des klaren Überstands werden in ein Zentrifugenröhrchen überführt, mit 15 mL 0,05 molarer Natriumdihydrogenphosphatlösung (pH 3) verdünnt und gegebenenfalls erneut zentrifugiert.

Für die Extraktion der Toxine aus flüssigen Probenmatrices werden jeweils fünf Gramm in einem Schraubverschluss-Zentrifugenröhrchen eingewogen, mit 15 mL eines Acetonitril-Methanol-Wasser-Gemischs vermengt und eine Minute lang geschüttelt. Danach wird der Extrakt analog zur festen Probe aufgearbeitet.

Für die Festphasenextraktion wird die Polymersäule zunächst mit 5 mL Methanol und 5 mL Wasser konditioniert. Danach wird die gesamte Probenlösung aufgegeben, das Probengefäß mit Wasser gespült und die Extraktionssäule mit 5 mL Wasser gewaschen. Nach einem Trocknungsschritt (etwa zehn Minuten unter Vakuum) werden die Analyte mit 5 mL Methanol und in einem zweiten Schritt mit 5 mL Acetonitril unter leichtem Vakuum eluiert. Der zur Trockne eingedampfte Extrakt wird in einem Milliliter Wasser/Methanol (7/3, v/v) wieder aufgenommen, in ein GC-Vial überführt und gegebenenfalls vorher durch einen Filter (0,45 µm Porengröße) filtriert. Für die Durchführung der LC/MS-MS-Bestimmung gelten exemplarisch die in Tabelle 1 und 2 aufgeführten Parameter. Tabelle 1 zeigt die Gradientenzusammensetzung, die MS/MS-Bedingungen sind in Tabelle 2 wiedergegeben.

Auswertung der Alternaria-Toxin Bestimmung

Die quantitative Bestimmung erfolgt mittels externer Matrixkalibrierung. Dazu wird eine unbelastete Leermatrix des zu untersuchenden Lebensmittels mit steigenden Konzentrationen eines Alternaria-Toxin-Mischstandards (5, 10, 25, 50, 75, 100 µg/kg) dotiert. Zur Bestimmung der Zuverlässigkeit der Methode erfolgt eine Validierung über jeweils fünf parallele Aufarbeitungen. Die Werte werden anschließend mittels Grubbs statistisch berechnet. Nachweis- und Bestimmungsgrenzen werden über das Signal/Rausch-Verhältnis ermittelt (Nachweisgrenze S/N über drei, Bestimmungsgrenze S/N über zehn). Für die Angabe zur Messunsicherheit gilt der Variationskoeffizient nach Horwitz.

Ergebnisse und Diskussion

Das vorgestellte Analysenverfahren erlaubt es, Alternaria-Toxine in festen und flüssigen Lebensmitteln qualitativ und quantitativ zu bestimmen. Für die Probenvorbehandlung wurde die Extraktion mit einem Gemisch aus Acetonitril, Methanol und Wasser im sauren Milieu durchgeführt. Anschließendes Verdünnen mit Phosphatpuffer führt zu einem Rohextrakt, der nachfolgend mittels SPE von Störsubstanzen befreit und zudem konzentriert wird. Als stationäre Phase wird ein hydroxyliertes Polymer auf PS-DVB-Basis verwendet, das sowohl für die Extraktion von sauren als auch basischen und neutralen Analyten geeignet ist. Das Polymerdesign (spezifische Oberfläche: 400 bis 450 Quadratmeter pro Gramm, Porosität: 100 Å, Partikelgrößenverteilung: 40 bis 55 µm) sorgt für gute Flusscharakteristik und eliminiert die Matrixeffekte, die ansonsten Ionensuppression verursachen würden. Typische Wiederfindungen für Alternaria-Toxine, z.B. aus Traubensaft, liegen zwischen 97 und 105 Prozent (s. Tabelle 3). Die Bestimmungsgrenze liegt bei 10 µg/L, die Nachweisgrenze bei 5 µg/L.

Für die Flüssigchromatographie wird eine Monochrom-MS-Säule verwendet, die eine besondere Selektivität gegenüber Verbindungen mit Elektronenpaardonator-Eigenschaften aufweist. Hierbei sind Pentafluorphenylgruppen über Alkylspacer an die Kieselgelmatrix gebunden. Durch den starken Elektronenzug der Fluoratome weist deren π-Elektronensystem einen starken Elektronenmangel auf. Unter RP-Bedingungen wird auf diesen Phasen eine starke Retention von Basen und elektronenreichen Verbindungen beobachtet, wozu verschiedene Wechselwirkungen beitragen. Dies sind Dipol-Dipol-Wechselwirkungen, Wasserstoffbrückenbindungen und π-π-Wechselwirkungen.

In Abbildung 2 ist die Trennung der einzelnen Alternaria-Toxine (Traubensaft, versetzt mit einer Standardlösung mit Konzentrationen von 25 µg/kg) dargestellt; Tenuazonsäure wird am wenigsten, Alternariamonomethylether am stärksten retardiert.

Zusammenfassung

Mit der beschriebenen Multimethode ist es möglich, die verschiedenen Alternaria-Toxine in Nahrungsmitteln sowohl qualitativ als auch quantitativ zu bestimmen. Für die Probenvorbereitung wird ein Rohextrakt hergestellt, der mittels Festphasenextraktion weiter gereinigt und konzentriert wird. Für die LC wird eine Pentafluorphenylphase verwendet, die eine gute Selektivität gegenüber den zu trennenden Verbindungen aufweist. Die Analyten werden mittels Elektrospray sowohl im positiven als auch negativen Modus ionisiert und mittels MRM-(Multiple Reaction Monitoring)-Verfahren mit einem Höchstmaß an Analysensicherheit bestimmt.

Literatur

[1] Stellungnahme des BfR vom 30. Juli 2003: Alternaria-Toxine in Lebensmitteln.

[2] Marita Wittkowski, Werner Baltes, Wolfhard Krönert, Rudolf Weber: Bestimmung von Alternaria-Toxinen in Obst- und Gemüseerzeugnissen, Z. Lebensm. Forsch. A, 177, 1983, 447-453.

[3] M. Kellert, W. Blaas, M. Wittkowski: Gaschromatographisch-massenspektrometrische Bestimmung von Alternaria-Toxinen in Obst- und Gemüseerzeugnissen, Fresenius J. Anal. Chem., 318, 1984, 419-424.

[4] Ulrike Kocher, CVUA, Sigmaringen, Multimethode zur Bestimmung von Alternaria-Toxinen mittels LC-MS-MS, 28. Mycotoxin-Workshop 2006 in Bydgoszcz und CVUA Sigmaringen, Jahresbericht 2005.

* Dr. L. Reinhold und I. Bartels, Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit, Lebensmittelinstitut Braunschweig, 38124 Braunschweig

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Über den Autor

Marc Platthaus

Marc Platthaus

Chefredakteur, LABORPRAXIS - Mehr Effizienz für Labor & Analytik