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Headspace-Techniken/Thermodesorption Ansatz zur Analyse von Vanilleschoten und -extrakten

Autor / Redakteur: GUIDO DEUßING* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Es gibt nicht eine Sorte Vanille, sondern zahlreiche. Deren Geschmacksmuster wird nicht allein durch Vanillin sondern durch eine Komposition hunderter verschiedener Verbindungen erzeugt. Zu deren Aufklärung leisten Headspace-Techniken und die Thermodesorption einen wichtigen Beitrag.

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(Bild: Fotolia)

Kaum ein Gewürz wird so häufig zur Aromatisierung eingesetzt wie Vanille – nicht nur zur Weihnachtszeit und auch nicht nur in Lebensmitteln. Vanillearoma findet ebenso Anwendung bei der Herstellung von Parfüm, Kosmetika und Arzneien. Der Vanille wird nachgesagt, sie beruhige den Geist und belebe den Körper. Man setzt das Gewürz in der Aromatherapie ein; inhaliert wirkt es entspannend und belebend auf den Körper, heißt es.

Vanille beruhigt den Magen

Wenige Tropfen Vanille, mit einem Glas Mineralwasser oder Fruchtsaft dem Organismus zugeführt, genügten, um einen gereizten, nervösen Magen zu beruhigen. Vanille neutralisiere scharfe oder saure Speisen, verstärke zugleich aber den Eigengeschmack flacher Aromen. Aktuell wird untersucht, ob Vanillin, der Hauptbestandteil des Vanillegewürzes, eine krebsvorbeugende Wirkung besitzt. Nicht ohne Grund, mag man meinen, sahen schon die Azteken in der Vanille einen geradezu göttlichen Nektar.

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Heute zählt Vanille zu den wichtigsten und beliebtesten Aromastoffen der Welt, wohl auch zu den teuersten: Rund 80.000 US-Dollar kostet eine Tonne [1] des Gewürzes. Bei diesem Preis steht außer Frage, die Güte der Ware mit Argusaugen zu überwachen: Im Fokus stehen vor allem Geschmack und Aroma, Authentizität und Herkunft und ebenso die Frage, ob Verfälschungen, Kontaminationen oder Qualitätsmängel vorliegen. Das zu überprüfen, liegt im Interesse des Endverbrauchers, insbesondere aber des verarbeitenden Betriebes, der Vanille in seiner Produktion einsetzt. Den erforderlichen Erkenntnisgewinn bietet einzig die instrumentelle Analytik.

Untersuchung von Vanille ist komplex

Allerdings erweist sich die Untersuchung von Vanille als Herausforderung: Mit einer einzigen Methode jedenfalls lasse sich Vanille nicht vollständig charakterisieren, bringt es Stephen J. Toth auf den Punkt. Zu komplex sei die Chemie der Vanille. Im Rahmen seiner Dissertation „Comparison and Integration of Analytical Methods for the Characterization of Vanilla Chemistry“ [1] an der State University of New Jersey, USA, hat sich der Wissenschaftler damit beschäftigt, einen integrierten analytischen Ansatz zu finden, um ganze fermentierte Vanilleschoten und Vanilleextrakte auf ihre flüchtigen und schwerflüchtigen Bestandteile zu analysieren.

Die Lösung lag, so seine Schlussfolgerung, in der Kombination von Flüssig- und Gaschromatographie, wobei Toth vor allem den verschiedenen Headspace-Techniken und der Thermodesorption eine große Bedeutung beimisst.

Bestimmung der Bestandteile durch Chromatographie

Für die Bestimmung schwerflüchtiger Vanillebestandteile wie Vanillin, 4-Hydroxybenzaldehyd, Vanillinsäure und 4-Hydroxybenzoesäure lässt sich die HPLC einsetzen. Stephen J. Toth weist in seiner Dissertation auf eine Vielzahl in der Literatur beschriebener HPLC-Methoden hin (vornehmlich eingesetzt zur Analyse von Vanilleextrakten), die ihm eine Orientierung bei der Methodenentwicklung boten. Die Leistung des von Toth verwendeten Standard-HPLC-Systems (mit UV-Detektor) ließ sich – bis zur Limitierung durch technische Beschränkungen der Maschine – deutlich steigern. Wie seine Experimente zeigten, bot vor allem der Einsatz von UPLC-Säulen, also kurzen Säulen mit geringer Partikelgröße (Säulen-Beispiel: 50 mm lang x 4,6 mm x 1,8 µm), einiges Optimierungspotenzial, um die Analysezeit zu verkürzen.

Man habe zwar ziemlich mit den Geräteparametern spielen und einige Modifikationen an der Hardware vornehmen müssen, letztlich jedoch habe Toth eine um das Siebenfache schnellere Trennung als zu Anfang der Messreihe realisiert. Die ursprüngliche HPLC-Analysezeit für Vanillephenol sei von 13,45 auf 1,86 min reduziert worden. „Das stellt so ziemlich das beste Ergebnis dar, das von einem konventionellen HPLC-System mit UPLC-Säule erwartet werden kann“, schreibt Toth. Obendrein habe sich der Verbrauch von Acetonitril um rund zwei Drittel reduzieren lassen.

HPLC nur begrenzt geeignet

Ungeachtet dieses Erfolges eignet sich die HPLC nur in begrenztem Maß, die Gesamtheit der flüchtigen Verbindungen in der Vanille zu identifizieren, geschweige denn bislang unbekannte Aromakomponenten zu identifizieren, meint Toth. Wie die Praxis zeigt, taugt hierfür aber die Gaschromatographie in Verbindung mit Headspace-Techniken und der massenselektiven Detektion.

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Um einen Überblick zu erhalten, womit sich die besten Resultate erzielen lassen, verglich der Wissenschaftler folgende Techniken miteinander: die Solid Phase Micro Extraction (SPME), die Headspace Sorptive Extraction (HSSE) unter Einsatz des Gerstel-PDMS-Twisters und die dynamische Headspace-Technik. Zudem erfolgte eine direkte thermische Desorption (DTD) tiefgekühlt gemahlener Vanilleschoten. Untersucht wurde u.a. die aromatische Zusammensetzung zweier Bourbon-Vanilleschoten, wobei es sich um eine einwandfreie („gute“) Schote handelt,e beziehungsweise um eine vom Handel abgelehnte „schlechte“ Schote, die einen alkoholischen Fremdgeruch besaß; der Verdacht ging in Richtung eines bakteriellen Abbaus u.a. von Vanillin zu Guajacol unter anaeroben Bedingungen.

Mehrfach wurde in der Literatur über den Nachweis von Vanilleextrakten mittels SPME berichtet, insbesondere von polaren Komponenten aus alkoholischer Matrix, schreibt Toth. Dank zahlreicher verfügbarer SPME-Extraktionsphasen, der einfachen Automatisierung und der schnellen Thermodesorption der angereicherten Analyten habe sich die SPME in den Experimenten als selektiv und praktisch bei der Extraktion flüchtiger Verbindungen aus dem Headspace erwiesen. Von Nachteil sei indes die geringe Phasenmenge (0,5 µL) gewesen. Entsprechend erweise sich die SPME zwar als praktisch und vielseitig, jedoch begrenzt in ihrer Sorptionskapazität, sprich: Sie ist wenig sensitiv, insbesondere für schwerflüchtige Verbindungen.

Der Versuch, eine Mischphase zu verwenden, hier mit Divinylbenzol (DVB), Carboxen (CBXN), Polydimethylsiloxan (PDMS), führte zur Extraktion von Analyten einer größeren Polaritätsbandbreite, ging allerdings auf Kosten der Sensitivität. Dessen ungeachtet wurden mittels SPME aus Vanille 35 Verbindungen extrahiert, darunter auch Schadstoffe aus Verpackungsmaterialien sowie acht bislang noch nicht identifizierten Komponenten.

Headspace Sorptive Extraction (HSSE)

Die HSSE ist eine Weiterentwicklung der Stir Bar Sorptive Extraction (SBSE), die sich bereits vielfach in der Bestimmung u.a. von Aromen bewährt hat [2], und basiert auf dem Einsatz des Gerstel-Twisters in der Funktion als Passivsammler: Bei der SBSE extrahiert der Twister die Analyten, während er die Probe durchmischt. Bei der HSSE wird der Twister im Dampfraum über der Probe im Vial montiert; die Extraktion der Analyten erfolgt also aus dem Headspace. Sobald sich ein stabiles Gleichgewicht der Analyten zwischen Sorptionsphase und Headspace/Probe eingestellt hat, wird der Twister entnommen.

Die thermische Desorption und Überführung der Analyten auf den GC erfolgt (wie bei der SBSE) mittels der Gerstel Thermal Desorption Unit (TDU), automatisiert mit dem Gerstel Multi Purpose Sampler (MPS). Aufgrund seines gegenüber der SPME (0,5 µL) signifikant größeren Phasenvolumens (PDMS-Twister: 125 µL) erweist sich die HSSE als besonders sensitiv für mittel- bis unpolare Verbindungen im Spurenbereich. Inzwischen ist ein Ethylen-Glycol-Silikone-Twister verfügbar, der für die Extraktion polarer und unpolarer Verbindungen ausgelegt ist. Insgesamt wurden 19 Verbindungen identifiziert, darunter vier neue, die im Zuge der Vanilleanalyse bislang noch nicht bestimmt und dokumentiert worden waren.

Dynamische Headspace-Technik analysiert neue Verbindungen

Mithilfe eines Trägergases, das unter Druck oder Anlegung eines Vakuums durch den Headspace der Probe geleitet wird, werden die Analyten in der Probe ab- und auf einem nachgeschalteten geeigneten Trägermaterial angereichert (im vorliegenden Fall handelte es sich um Tenax TA). Im Gegensatz zu SPME und HSSE zeigte Tenax TA keine spezifische Affinität auf bestimmte Verbindungsklassen, sondern reicherte Analyten über einen etwas weiteren Siede- und Polaritätsbereich an. Schwierigkeiten hätten allerdings solche mit drei oder weniger Kohlenstoffatomen bereitet, schreibt Toth. Insgesamt habe er in der hochwertigen Vanille mittels Purge&Trap-Verfahren 24 Verbindungen identifiziert, darunter zehn bislang noch nicht in Vanille gefundene Komponenten.

Direkte Thermische Desorption (DTD): Die Probe wurde in einem Glasröhrchen (Liner) zwischen zwei Pfropfen aus Glaswolle gegeben und in der Thermal Desorption Unit (TDU) über eine Temperaturrampe (30 °C – 60 °C/min – 275 °C) ausgeheizt. Die Analyten wurden im Kalt-Aufgabe-System (KAS) des verwendeten Agilent GC 6890 cryofokussiert und anschließend temperaturprogrammiert auf die GC-Säule überführt. Die elektronische Druckkontrolle (EPC) des GC erlaubt es, die Geschwindigkeit des Trägergasflusses unabhängig von der Ofentemperatur konstant zu halten. „Wir erreichten eine maximale Auflösung“, schreibt Toth.

In der untersuchten „guten“ wie „schlechten“ Vanilleschote identifizierte Toth mittels der DTD-TDU-GC/MS-Methode jeweils 74 Verbindungen (weitere Analysen förderten 30 bislang nicht in Vanilleschoten gefundene Verbindungen zutage). Bemerkenswert sei der Unterschied der Vanillin-Konzentration gewesen: In der „guten“ Vanilleschote lag er bei 1,2%, in der „schlechten“ nur bei 0,1%. In der vom Handel akzeptierten Vanilleschote fand Toth hohe Konzentrationen an Essigsäure, 2-Methoxyphenol, Hydroxydihydromaltol, 5-(Hydroxymethyl)furan-2-Carbaldehyd, 4-Hydroxybenzaldehyd, Vanillin, Hexadecansäure und 1-Octadecanol. „Die identifizierten Verbindungen für diese Bourbon-Vanilleschote stimmen mit vorherigen Daten, die in der Literatur dokumentiert wurden, überein“, schreibt Toth.

Zum ersten Mal in Vanilleschoten dokumentieren konnte er unter anderem Aceton, 2-Methylpropanal, 3-Hydroxy-3-Penten-2-on, 2(5H)-Furanon, 2-Hydroxy-2-Cyclopenten-1-on, 4-Hydroxy-5-Methyl-3(2H)-Furanon, 2-Furancarboxylsäure, Lilialsäure, 4-(4-Hydroxyphenyl)-3-Buten-2-on, 4-(4-Hydroxy-3-Methoxy-phenyl)-3-Buten-2-on (E), zwei Isomere von Vanillinglycerylacetal, 1-Octadecanol, Ethylheptadecanoat, Ethyloctadecanoat, z-12-Pentacosen und z-14-Nonacosen. In der „schlechten“ Schote bestimmte Toth hohe Konzentrationen an 2-Methoxyphenol, 2-Methoxy-4-Methylphenol, Vanillin, Hexadecansäure und 1-Octadecanol.

Kombination der Techniken zeigt Gesamtbild

Zu den größten Unterschieden zwischen der „guten“ und „schlechten“ Bourbon-Vanilleschote, die durch die DTD-TDU-GC/MS-Analyse aufgedeckt wurden, zähle der Verlust von Vanillin, die Erhöhung von 2-Methoxy-4-methylphenol und 2-Methoxyphenol sowie der Verlust von Hydroxydihydromaltol und Hydroxymethylfurfural, schreibt Toth. Das Fehlen eines Konzentrationsschrittes für DTD-TDU-GC/MS im Gegensatz zu den anderen Headspace-Methoden könnte die Auslassung der Fuselalkohole erklären, die in den SPME-, HSSE- und Purge&Trap-Experimenten gefunden wurden. Dass in der vom Handel abgelehnten Vanilleschote unterschiedliche Mengen an Fuselalkoholen nachgewiesen wurden, mache die unterschiedlichen Stärken jeder einzelnen Headspace-Technik deutlich. Während jede ihre Schwächen haben mag, fördert ihre Kombination, das Gesamtbild der Inhaltsstoffe einer Aromaprobe vollends rund zu machen. Als günstig erweist es sich für den Anwender, wenn er auf alle Headspace-Techniken (SPME, HSSE, dynamischer Headspace und die direkte thermische Desorption) zurückgreifen kann. Realisieren lassen sie sich jedenfalls auf einem automatisierten Komplettsystem.

* G. DEUßING:Redaktionsbüro Guido Deußing, 41464 Neuss, Tel. +49 (0) 21 31 / 74 16 06

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