Lösungsmittel Auswahl des richtigen Lösungsmittels in der (U)HPLC

In der Hochdruckflüssigchromatographie muss es fließen – die Auswahl des Lösungsmittels ist enorm wichtig. Mittlerweile können Anwender je nach Bedarf auf unterschiedlichste Varianten zurückgreifen. Was versteht man zum Beispiel unter der Bezeichnung LC-MS grade?

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Es wird immer wieder betont, wie wichtig es ist, in der HPLC hochreine Lösungsmittel als mobile Phase einzusetzen. Dazu stehen dem Anwender unterschiedliche Reinheitsgrade zur Verfügung, wie z.B. HPLC grade, Gradient grade oder LC-MS grade. Doch worin liegt für die Chromatographie der Unterschied zwischen den verschiedenen Qualitäten und zu Lösungsmitteln p.a., die ebenfalls eine hohe Reinheit aufweisen? Und wieso ist es sinnvoll, ein Lösungsmittel mit einer Qualität gemäß der durchzuführenden Applikation einzusetzen?

Allen Qualitäten eines Lösungsmittels ist gemein, dass sie von dem gleichen Rohstoff abstammen und nominell eine hohe Reinheit mit nur geringen Spuren an Fremdsubstanzen aufweisen (99,8 bis 99,9 %, je nach Produkt). Doch genau diese minimalen Rückstände können in der Chromatographie je nach Detektionsart durchaus Probleme bereiten, sodass in diesem Fall „rein“ nicht mit „rein“ gleichzusetzen ist.

Im Folgenden werden die Unterschiede zwischen den drei Kategorien an Lösungsmittel-Qualitäten und der Sinn der Verwendung einer entsprechenden Qualität dargestellt.

HPLC grade

HPLC grade beschreibt die Qualität von Lösungsmitteln, die v.a. für die isokratische Trennung unter Anwendung von UV- oder Fluoreszenzdetektoren konzipiert sind. Diese Lösungsmittel zeichnen sich durch eine hohe Reinheit mit hoher UV-Durchlässigkeit bei allen relevanten Wellenlängen, niedriger Eigenfluoreszenz sowie geringem Abdampfrückstand und geringer Acidität und Alkalität aus.

Die Lösungsmittel werden speziellen Reinigungsschritten unterzogen, um mögliche interferierende Substanzen zu entfernen. Dadurch werden Störpeaks durch Verunreinigungen minimiert und ein geringes chromatographisches Grundrauschen ermöglicht. Nach ihrer Reinigung werden sie spezifisch auf ihre Eignung für die UV- und Fluoreszenz-Detektion in der HPLC getestet.

Durch die Qualitätskontrolle ist gewährleistet, dass der Anwender immer die gleiche Lösungsmittel-Qualität erhält und die Reproduzierbarkeit der HPLC-Analytik sichergestellt ist.

Gradient grade

Für die chromatographische Trennung von Substanzen wird in der HPLC neben der isokratischen häufig auch die Gradientenelution eingesetzt. Bei dieser verändert sich innerhalb eines Laufes die Zusammensetzung der mobilen Phase, so nimmt z. B. im Falle der Reversed Phase-Chromatographie der Organik-Anteil zu. Dies kann bei Lösungsmitteln, die nicht speziell für die Gradiententrennung hergestellt wurden, zu einem teils deutlichen Anstieg der Basislinie bei der UV-Detektion führen und die Sensitivität der Methode empfindlich beeinträchtigen. Für eine optimale Chromatographie auch unter den Bedingungen eines Gradienten werden daher Gradient grade Lösungsmittel weiter aufgereinigt. Neben ihrer Eignung für die UV- und Fluoreszenzdetektion werden sie auch spezifisch auf ihre Eignung für die Gradiententrennung hin überprüft, so dass auch bei Gradient grade Lösungsmitteln eine chargenkonsistente Qualität gewährleistet ist.

LC-MS grade

Mit dem Einzug der (Ultra-)Hochdruckflüssigkeitschromatographie (U)HPLC-Massenspektrometrie (MS) in die Labore ergaben sich aufgrund der hohen Nachweisempfindlichkeit und der Art der Analyse neue Anforderungen an die verwendeten Lösungsmittel. So ist das Augenmerk bei der Anwendung in der Massenspektrometrie vor allem auf eine hohe Ionisationseffizienz bei gleichzeitig geringem Ionenhintergrund gerichtet. Dazu werden die Lösungsmittel entsprechend aufgereinigt. Wichtig hierbei sind vor allem die Entfernung von Spurenelementen, organischen Stoffen und (Metall-)Ionen. Diese können zu einem erhöhten Grundrauschen und einer Adduktbildung mit den zu analysierenden Substanzen führen, was die Nachweisempfindlichkeit deutlich herabsetzen kann. Zur Qualitätskontrolle werden die Lösungsmittel gegen Reserpin (m/z 609,49) als Standard getestet. Über den getesteten Massenbereich sind ein nur geringes Grundrauschen sowie keine durch Verunreinigungen verursachten Signale zu verzeichnen. LC-MS grade Lösungsmittel sind aufgrund ihrer sehr hohen Reinheit zudem auch besonders für die Anwendung in der UHPLC geeignet. Sie garantieren eine lange Lebensdauer der UHPLC-Säulen. Deshalb werden sie zusätzlich auch auf ihre Eignung für die UV- und Fluoreszenz-Detektion überprüft.

Fazit

Die unterschiedlichen Lösungsmittelqualitäten haben durchaus ihre Daseinsberechtigung. Der Einsatz von Lösungsmitteln einer der Analytik angemessenen Qualität ist sinnvoll und auch zu empfehlen. Nur so ist eine chargenunabhängige Chromatographie, mit der der Anwender exakte und reproduzierbare Ergebnisse erhält, gewährleistet.

* A. Gilljohann: Altmann Analytik GmbH & Co. KG, 81379 München

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