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Lebendzell-Mikroskopie Automatisches Tracking von biologischen Partikeln in Zellen

Autor / Redakteur: Karl Rohr* und William J. Godinez* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Dem automatischen Tracking von biologischen Partikeln in Lebendzell-Mikroskopiebildern kommt für die quantitative Analyse von intrazellulären dynamischen Prozessen eine hohe Bedeutung zu. Ein neues hochleistungsfähiges Partikel-Tracking-Verfahren bietet entscheidende Vorteile.

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Abb. 1a Tracking-Ergebnis für Viruspartikel: Mikroskopiebild von zeitaufgelösten Daten überlagert mit automatisch ermittelten Trajektorien von HIV-1 Partikeln (in verschiedenen Farben). Die Kästchen geben die gefunden Positionen zum aktuellen Zeitpunkt an. (weißer Rahmen: Ausschnitt der Vergößerung ...)
Abb. 1a Tracking-Ergebnis für Viruspartikel: Mikroskopiebild von zeitaufgelösten Daten überlagert mit automatisch ermittelten Trajektorien von HIV-1 Partikeln (in verschiedenen Farben). Die Kästchen geben die gefunden Positionen zum aktuellen Zeitpunkt an. (weißer Rahmen: Ausschnitt der Vergößerung ...)
(Bild: Uni Heidelberg)

Die Bewegungsverfolgung von biologischen Partikeln wie Viruspartikel, Zellkernpartikel oder Zellrezeptoren ist von zentraler Bedeutung für die quantitative Analyse von intrazellulären dynamischen Prozessen in Lebendzell-Mikroskopiebildern. Da eine manuelle Auswertung von zeitaufgelösten Bilddaten, die hunderte oder tausende sich bewegender individueller Partikel zeigen, im Allgemeinen nicht durchführbar ist, sind automatische Bildanalyseverfahren zum Partikel-Tracking notwendig. Diese computergestützten Verfahren ermitteln die Positionen von Partikeln über die Zeit hinweg. Dabei müssen Partikel in einzelnen Bildern einer zeitaufgelösten Bildsequenz gefunden und die Korrespondenzen der Partikel in aufeinander folgenden Bildern ermittelt werden. Die Bestimmung der Korrespondenzen ist insbesondere dann schwierig, wenn die Anzahl der Partikel in den Bildern groß ist und die Partikel örtlich nah beieinander sind, d.h. wenn die Partikeldichte relativ hoch ist.

Weitere Herausforderungen sind die geringe Größe der Partikel in den Bildern und das häufig starke Bildrauschen (bzw. das geringe Signal-zu-Rauschverhältnis) sowie andere Bildartefakte wie Photobleaching. Außerdem ist die Vielfalt an Mikroskopiebilddaten aufgrund unterschiedlicher Bildgebungstechniken und Fluoreszenzfärbungsmethoden sehr groß.

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Probabilistisches Verfahren für Partikel-Tracking

Um mit den genannten Herausforderungen zurechtzukommen, wurde von den Autoren ein neues Verfahren zum automatischen Tracking von biologischen Partikeln entwickelt. Das Verfahren zeichnet sich dadurch aus, dass im Unterschied zu bisherigen deterministischen Verfahren die Unsicherheiten in den Bilddaten (z.B. durch Bildrauschen) und Wissen über die Anwendungsdomäne (z.B. Objektform und Bewegung) durch eine mathematisch fundierte probabilistische Methode berücksichtigt werden. Dadurch lässt sich eine hohe Genauigkeit insbesondere bei schwierigen Bilddaten mit einer großen Objektanzahl, hoher Objektdichte und starkem Rauschen erzielen.

Ausgehend von der Beobachtung, dass sich biologische Partikel in Mikroskopiebildern i.A. durch spotförmige Strukturen darstellen, werden bei diesem probabilistischen Tracking-Verfahren die Form, Signalstruktur und Bewegung von einzelnen Partikeln durch Wahrscheinlichkeitsverteilungen repräsentiert. Biologische Partikel werden in den Bilddaten automatisch gefunden (detektiert) und über die Zeit hinweg verfolgt, d.h. es werden die Korrespondenzen in aufeinanderfolgenden Bildern eines Videos automatisch bestimmt. Für örtlich-zeitliche Filterung werden Kalman-Filter und Partikel-Filter (sequenzielle Monte-Carlo-Methoden) verwendet.

Das neue probabilistische Partikel-Tracking-Verfahren ist für mehrkanalige zeitaufgelöste 2D- und 3D-Mikroskopiebilddaten geeignet, und kommt mit relativ hoher Objektdichte sowie starkem Bildrauschen zurecht. Das Verfahren ermöglicht nicht nur die Bestimmung der Bewegungspfade (Trajektorien) von Objekten sowie die Quantifizierung von relevanten Parametern (z.B. Geschwindigkeit, Weglänge, Bewegungstyp, Objektgröße), sondern auch die automatische Erkennung von wichtigen dynamischen Ereignissen wie beispielsweise Virus-Zell-Fusionen (Godinez et al., Medical Image Analysis 2009, IEEE Transactions on Medical Imaging 2012, Rohr et al., Cold Spring Harbor Protocols 2010). In den Abbildungen 1 und 2 sind Beispiele für automatisch ermittelte Trajektorien von Virus-Partikeln für 2D- und 3D-Bilddaten zu sehen. Abbildung 3 zeigt einen Bildausschnitt mit zwei sich kreuzenden Trajektorien.

Mit diesem Verfahren haben die Autoren bei einem internationalen Leistungsvergleich von Partikel-Tracking-Verfahren teilgenommen. Diese so genannte „Partikel Tracking Challenge“ wurde erstmalig durchgeführt, um die Leistungsfähigkeit existierender Verfahren objektiv zu untersuchen.

Exzellente Ergebnisse bei internationalem Wettbewerb

Eine Hauptmotivation zur Durchführung dieses Leistungsvergleichs bestand darin, dass es mittlerweile eine Reihe verschiedener Verfahren für Partikel-Tracking gibt, deren Leistungsfähigkeit für einen Anwender jedoch schwer einschätzbar ist und daher die Auswahl eines optimalen Verfahrens für experimentelle Bilddaten kaum möglich ist. Bei dem Wettbewerb wurden die verschiedenen Verfahren für ein großes Spektrum an teilweise sehr schwierigen 2D- und 3D-Bilddaten unterschiedlicher Kategorien und Objekte (z.B. Viren, Zellvesikel, Zellrezeptoren) angewendet und die Performanz durch verschiedene Maße quantifiziert. Die Ergebnisse dieses Wettbewerbs wurden beim „IEEE International Symposium on Biomedical Imaging 2012“ in Barcelona präsentiert und kürzlich publiziert [1].

Insgesamt nahmen 14 Forschungsgruppen die Herausforderung des wissenschaftlichen Wettbewerbs an (z.B. Yale University, Stanford University, MPI Dresden, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, Institut Pasteur, Paris, und KTH Royal Institute of Technology, Stockholm). Das von den Autoren in Heidelberg neu entwickelte Verfahren lieferte für die 2D- und 3D-Bilddaten des Wettbewerbs sehr gute Ergebnisse. Es zeigte sich auch, dass das Verfahren mit Bilddaten unterschiedlicher Objekte sehr gut zurechtkommt. Um die verschiedenen Verfahren miteinander vergleichen zu können, wurden für jede Kategorie der Bilddaten die drei besten Verfahren ermittelt und die Anzahl der Top-3-Ränge für alle Bilddaten bestimmt. Dabei zeigten sich deutliche Unterschiede zwischen den verschiedenen Verfahren. Die drei besten Verfahren erreichten 150, 124 und 103 Top-3-Ränge. Das hier vorgestellte Verfahren erzielte mit 150 Top-3-Rängen das beste Gesamtergebnis aller teilnehmenden Gruppen und war damit das genaueste Verfahren.

Das vorgestellte probabilistische Partikel-Tracking-Verfahren wird in enger Kooperation mit einer Reihe von biologischen Forschungsgruppen eingesetzt, v.a. mit Partnern am Universitätsklinikum Heidelberg zur Erforschung von Infektionskrankheiten durch Hepatitis-C-Viren (HCV) zusammen mit R. Bartenschlager sowie A. Ruggieri, und Humane Immundefizienz-Viren (HIV) zusammen mit B. Müller, H.-G. Kräusslich, D.C. Lamb (LMU München) sowie O.T. Fackler. Internationale Partner sind David M. Knipe von der Harvard Medical School in Boston, USA und David L. Spector vom Cold Spring Harbor Laboratory, New York, USA (z.B. [7, 5, 6]).

Literatur

[1] Chenouard N, Smal I, de Chaumont F, Maška M, Sbalzarini IF, Gong Y, Cardinale J, Carthel C, Coraluppi S, Winter M, Cohen AR, Godinez WJ, Rohr K, Kalaidzidis Y, Liang L, Duncan J, Shen H, Xu Y, Magnusson KEG, Jaldén J, Blau HM, Paul-Gilloteaux P, Roudot P, Kervrann C, Waharte F, Tinevez J-Y, Shorte SL, Willemse J, Celler K, van Wezel GP, Dan H-W, Tsai Y-S, Ortiz de Solórzano C, Olivo-Marin J-C, Meijering E. Objective comparison of particle tracking methods. Nature Methods, March 2014, Volume 11, Issue 3, 281–289; DOI: 10.1038/nmeth.2808

[2] Godinez WJ, Lampe M, Wörz S, Müller B, Eils R, and Rohr K: Deterministic and Probabilistic Approaches for Tracking Virus Particles in Time-lapse Fluorescence Microscopy Image Sequences, Medical Image Analysis 13:2 (2009) 325-342; DOI: 10.1016/j.media.2008.12.004

[3] Godinez WJ, Lampe M, Koch R, Eils R, Müller B, and Rohr K. Identifying Virus-Cell Fusion in Two-Channel Fluorescence Microscopy Image Sequences Based on a Layered Probabilistic Approach, IEEE Transactions on Medical Imaging 31:9 (2012) 1786-1808; DOI: 10.1109/TMI.2012.2203142

[4] Rohr K, Godinez WJ, Harder N, Wörz S, Mattes J, Tvaruskó, Eils R.: Tracking and Quantitative Analysis of Dynamic Movements of Cells and Particles, Cold Spring Harbor Protocols 6 (2010); DOI: 10.1101/pdb.top80

[5] Ivanchenko S, Godinez WJ, Lampe M, Kräusslich HG, Eils R, Rohr K, Bräuchle C, Müller B, and Lamb DC. Dynamics of HIV-1 Assembly and Release, PLoS Pathogens 5:11 (2009) e1000652; DOI: 10.1371/journal.ppat.1000652

[6] Koch P, Lampe M, Godinez WJ, Müller B, Rohr K, Kräusslich H-G, and Lehmann MJ. Visualizing fusion of pseudotyped HIV-1 particles in real time by live cell microscopy, Retrovirology 6:84 (2009); DOI:10.1186/1742-4690-6-84

[7] Chang L, Godinez, WJ, Kim IH, Tektonidis M, de Lanerolle P, Eils R, Rohr K, Knipe DM. Herpesviral replication compartments move and coalesce at nuclear speckles to enhance export of viral late mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (PNAS) 108:21 (2011) E136-E144; DOI: 10.1073/pnas.1103411108

* PD Dr. K. Rohr, Dr. W. J. Godinez: Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg, BioQuant-Zentrum und IPMB Abt. Bioinformatik und Funktionelle Genomik; Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ), Abteilung Theoretische Bioinformatik, Forschungsgruppe Biomedical Computer Vision, 69120 Heidelberg

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