Vergleichbare Daten dringend gebraucht Automatisierte Analyse von Mikroplastik in großen FTIR-Imaging-Datensätzen

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Derzeit erschwert der Mangel an Standardisierung und Harmonisierung bei der Mikroplastik-Analyse die Vergleichbarkeit von Studien. Der erfolgreiche Vergleich zweier automatisierter Analyseverfahren für Mikroplastik-Daten zeigt, dass Methoden-Standardisierung und -Harmonisierung in Zukunft ein zentrales Forschungsziel sein muss.

Die Verschmutzung der Umwelt durch Mikroplastik zeigt sich mittlerweile in allen Ökosystemen – selbst in entlegenen Gebieten weitab von Bevölkerungszentren. Sie ist daher als globales Problem einzustufen. Potenzielle ökologische Risiken sind bekannt, bisher ist jedoch weitgehend unklar, welche konkreten Folgen die Kontamination der Umwelt mit den winzigen Kunststoff-Partikeln (< 5 mm) hat. Für eine genaue Risikobewertung dieser heterogenen Gruppe an Umwelt-Kontaminanten werden zuallererst verlässliche Daten zur Kontamination verschiedener Umweltkompartimente gebraucht [1]. Hier sind zuverlässige Analysemethoden nötig, um Mikroplastik in unterschiedlichen Umweltproben qualitativ und quantitativ zu identifizieren und belastbare Daten zu generieren [2].

Stand der Forschung

Der Mangel an Standardisierung und Harmonisierung in allen Bereichen der Mikroplastik-Analytik, von der Probenahmemethodik über die Probenaufbereitung bis hin zu den Analysemethoden sowie der Datenanalyse stellt indes ein großes Problem dar, das die Vergleichbarkeit und Reproduzierbarkeit von Studien in großen Teilen erschwert. Mittlerweile ist klar, dass belastbare Daten – gerade für kleinere Mikroplastik-Partikel – nur durch die Identifikation mittels chemisch-analytischer Methoden möglich sind, rein optisch-visuelle Methoden sind zu fehleranfällig [3]. Hier haben sich für die Mikroplastikanalyse zwei unterschiedliche methodische Richtungen etabliert:

• thermoanalytische Verfahren wie Pyrolyse- oder Thermo-Extraktion/Desorption-Gaschromatographie-Massenspektrometrie (TED-GC/MS) ergeben Daten zur Masse an Mikroplastik pro Polymersorte in der Probe,

• spektroskopische Verfahren wie Fourier-Transformations-Infrarot (FTIR) oder Raman Spektroskopie resultieren in Daten zur Partikelanzahl, Größe und Form der Mikroplastikpartikel pro Polymersorte in der Probe.

Während die massenbasierten Daten der thermoanalytischen Verfahren für die Bilanzierung von Mikroplastik-Flüssen und Modellierungsansätze notwendig sind, werden für ökotoxikologische Fragestellungen und die Risikobewertung die Daten spektroskopischer Methoden gebraucht, da Partikelanzahl, Größe und Form der Mikroplastik-Partikel sich auf die Interaktion mit Lebewesen und die Aufnahmewahrscheinlichkeit durch Organismen auswirken [1].

Neuere Studien haben gezeigt, dass in Bezug auf die Größenverteilung die Häufigkeit von Mikroplastik in der Umwelt mit abnehmender Größe stark ansteigt und kleines Mikroplastik daher bei der Bewertung der Umweltkontamination nicht vernachlässigt werden sollte. Aufgrund ihrer geringen Größe und ihres hohen Vorkommens ist eine manuelle Analyse von Mikroplastik-Partikeln < 500 µm nicht durchführbar [4]. Solche Partikel können nicht mehr aus einer Probe aussortiert und einer spektroskopischen Einzelanalyse unterzogen werden, sondern müssen nach einer effektiven Probenaufreinigung zur spektroskopischen Analyse auf Filter aufgebracht werden [5]. Zur Analyse solcher Filter sind schnelle, automatisierte und hochgenaue Analysemethoden erforderlich, die einen hohen Probendurchsatz ermöglichen.

Hier hat sich die spektroskopische Methode des Focal plane array detector (FPA)-basierten Mikro-Fourier-Transformations-Infrarot (μFTIR)-Imaging als hocheffizienter Ansatz für die Mikroplastik-Analyse erwiesen [6]. Durch die gleichzeitige Aufnahme von Tausenden von Spektren innerhalb einer einzigen Messung in kürzester Zeit ermöglicht diese Technik die chemische Bildgebung mit hoher lateraler Auflösung, was sie zu einem leistungsstarken Werkzeug für die Mikroplastik-Analyse ganzer Probenfilter macht. Sie liefert nicht nur Informationen über den Polymertyp, sondern auch über die Anzahl, Form und Größen­verteilung der Mikroplastik-Partikel [6].

Die erzeugten Datensätze sind riesig und beinhalten bis zu mehrere Millionen IR-Spektren, sodass eine manuelle Auswertung der Daten schlichtweg nicht machbar ist (s. Abb. 1). Hierfür werden Computer-Algorithmen gebraucht, welche die Daten hinsichtlich der unterschiedlichen Polymersorten des Mikroplastiks in der Probe automatisiert analysieren [7, 8, 9]. Mittlerweile gibt es hierfür Software-Lösungen, die bislang jedoch noch nicht auf die Vergleichbarkeit ihrer Ergebnisse getestet wurden. Wie bereits beschrieben ist die Standardisierung und Harmonisierung in allen Bereichen der Mikroplastik-Analytik notwendig um die Vergleichbarkeit von Daten zu gewährleisten, dies betrifft daher gerade auch die vorher genannte automatisierte Auswertung der erzeugten spektroskopischen Daten.

Automatisierte Analyse von Mikroplastik

Zwei gut etablierte und häufig angewendete Algorithmen zur Identifizierung von Mikroplastik-FTIR-Spektren in gemessenen Proben sind vom Alfred-Wegener-Institut, Helmholtz-Zentrum für Polar- und Meeresforschung (AWI) und von der Universität Bayreuth unabhängig voneinander entwickelt worden: das siMPle/MPAPP Analysetool (systematic identification of MicroPlastics in the environment) [7] und der BPF (Bayreuth Particle Finder) [8, 9].

Dabei nutzt siMPle/MPAPP eine Kombination aus einer automatisierten Spektrenanalyse mit anschließender Bildanalyse. Mittels der Pearson-Korrelation werden die Messspektren mit einer Datenbank mit Polymerspektren sowie natürlichen Materialen wie Zellulose (z. B. Baumwollfasern, aber auch andere zellstoffbasierte Materialen) und natürlichen Polyamiden (z. B. Tierhaare) abgeglichen. Dabei wird jedes Messspektrum über zwei unterschiedliche Verfahren jeweils mit der Datenbank abgeglichen und nur, wenn beide Male derselbe Materialtyp ermittelt wird, wird das Spektrum als identifiziert anerkannt. Die identifizierten Mikroplastik-Partikel werden je nach Polymer in einer anderen Farbe im µFTIR-Image markiert, anschließend mittels Bildanalyse ausgewertet und Polymertyp, Größe und Form (Partikel oder Faser) festgehalten.

Der BPF nutzt einen anderen Ansatz und basiert auf speziellen Klassifikatoren, die mittels eines so genannten random decision forests in ein Multiklassenmodel überführt werden, um die unterschiedlichen Kunststoffpolymere zu identifizieren. Dabei werden nicht alle Informationen aus dem Spektrum verarbeitet, sondern nur Bereiche, die eine essenzielle spektrale Information für eines der untersuchten Kunststoffpolymere enthält. Derzeit kann der BPF 22 unterschiedliche Kunststoffpolymere identifizieren. Auch hier werden die identifizierten Mikroplastik-Partikel je nach Polymer in einer anderen Farbe im µFTIR-Image markiert und Daten zu Polymertyp, Größe und Form der Mikroplastik-Partikel erzeugt. Beide Algorithmen haben den Vorteil, dass die großen μFTIR-Imaging-Messdaten in ihrer Gesamtheit untersucht werden können. Dadurch lassen sich Verzerrungen vermeiden, die entstehen, wenn nur ein Teil einer Probe analysiert wird und die Analyseergebnisse danach auf die Gesamtheit der Probe hochgerechnet werden.

Vergleich der Ergebnisse

Innerhalb einer Studie wurden nun erstmals die beiden oben vorgestellten Algorithmen hinsichtlich ihrer Ergebnisse verglichen [10]. Hierzu wurden zwei reale Umwelt-Probensätze jeweils mit beiden Auswertealgorithmen untersucht. Der eine Probensatz enthielt zehn Wasserproben aus der Ober- und Mittelweser, der andere Probensatz zehn Wasserproben, die aus der Unter-/Außenweser und dem Jadebusen stammten. Gemessen wurden Menge und Größe der Mikroplastik-Partikel sowie die Anteile verschiedener Polymere. Um die Datensätze der siMPle/MPAPP und der BPF-Analyse zu vergleichen, wurden die Mikroplastik-Polymerdaten zuallererst harmonisiert. Hierfür wurden vergleichbare Polymertypen (z. B. mit gleichen funktionellen Gruppen, wie Terephthalaten oder Styrolen) identifiziert und gegebenenfalls zu Clustern gruppiert. Polymertypen, die nur von einem Analysetool abgedeckt werden, wurden ausgeschlossen.

Insgesamt gesehen stimmen die Ergebnisse der beiden unterschiedlich arbeitenden Algorithmen in großen Teilen überein (s. Abb. 2). In den meisten Fällen wurden ähnliche Partikelanzahlen nachgewiesen, wobei im Probenset A eine bessere Übereinstimmung gefunden wurde als in Probenset B. Dort zeigten sich deutliche Abweichungen in den Partikelzahlen gerade für die Proben B-01, B-02 und B03. Es wurden höhere Zahlen mittels siMPle/MPAPP gefunden als mit dem BPF.

Über das gesamte Probenset B hinweg wurden deutlich größere Differenzen in der Polymerzusammensetzung gefunden als in Probenset A. Dabei war auffällig, dass die meisten Abweichungen im Bereich von Partikeln, die kleiner als 50 Mikrometer sind, auftraten (s. Abb. 3, online), insbesondere bei Messfiltern mit höheren Restverschmutzungen aus der Umweltmatrix. Hier können die Algorithmen infolge einer schlechteren FTIR-Spektrenqualität auch Fehlentscheidungen treffen und so Partikel übersehen oder Spektren falsch zuordnen. Bei den Ergebnissen der BPF-Analyse erfolgte daher eine manuelle Nachkontrolle der Ergebnisliste der automatisierten Auswertung. Bei der manuellen Nachkontrolle wurden z. B. falsch-postitiv identifizierte oder Partikel mit unklaren Spektren aus der Liste der Mikroplastik-Partikel entfernt, woraus die zum Teil niedrigeren Konzentrationen bei den Ergebnissen des BPF im Vergleich mit siMPle/MPAPP resultieren.

Resümee

Der Vergleich der beiden automatisierten Softwarelösungen zeigt, dass hier mittlerweile bei der Auswertung von großen µFTIR-Imaging-Datensätzen ein immenser Schritt in Richtung High-throughput Analysis gemacht wurde und unterschiedliche Lösungen zum Ziel führen können. Letztendlich zeigt die Studie aber auch, dass derzeit eine finale Überprüfung der Ergebnisse durch trainiertes Fachpersonal – unabhängig von der gewählten Softwarelösung – notwendig ist, um die größtmögliche Qualität und 100-prozentig belastbare Daten zu erhalten. In diesem Zusammenhang sind weitere vergleichende Forschungsarbeiten notwendig, damit Mikroplastik-Partikel aller Größen mittels automatisierter Verfahren künftig vollautomatisch und fehlerfrei identifiziert werden können.

Literatur:

[1] Kögel, T., Bjorøy, Ø., Toto, B., Bienfait, A.M., Sanden, M. 2020. Micro- and nanoplastic toxicity on aquatic life: determining factors. Science of the Total Environment; 709 :136050. https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2019.136050.

[2] Primpke, S., Booth, A.M., Gerdts, G., Gomiero, A., Kögel, T., Lusher, A., Strand, J., Scholz-Böttcher, B.M., Galgani, F., Provencher, J., Aliani, S., Patankar, S. and Vorkamp, K. 2023. Monitoring of microplastic pollution in the Arctic: recent developments in polymer identification, quality assurance and control, and data reporting. Arctic Science 9(1), 176-197. https://doi.org/10.1139/as-2022-0006.

[3] Löder, M. G. J. and Gerdts, G. 2015. Methodology used for the detection and identification of microplastics – a critical appraisal. Marine Anthropogenic Litter. M. Bergmann, L. Gutow and M. Klages. Berlin, Springer: 201-227.

[4] Primpke, S., Imhof, H., Piehl, S., Lorenz, C., Löder, M.G.J., Laforsch, C. and Gerdts, G. 2017. Mikroplastik in der Umwelt. Chemie unserer Zeit 51(6), 402-412. https://doi.org/10.1002/ciuz.201700821.

[5] Löder, M. G. J., Imhof, H. K., Ladehoff, M., Löschel, L. A., Lorenz, C., Mintenig, S., Piehl, S., Primpke, S., Schrank, I., Laforsch, C., and Gerdts, G. 2017. Enzymatic Purification of Microplastics in Environmental Samples. Environmental Science & Technology 51(24): 14283-14292.

[6] Löder, M.G.J., Kuczera, M., Mintenig, S., Lorenz, C., Gerdts, G. 2015. Focal plane array detector-based micro-Fourier-transform infrared imaging for the analysis of microplastics in environmental samples. Environmental Chemistry;12(5):563–81. https://doi.org/10.1071/EN14205.

[7] Primpke, S., Cross, R.K., Mintenig, S.M., Simon, M., Vianello, A., Gerdts, G. and Vollertsen, J. 2020. Toward the Systematic Identification of Microplastics in the Environment: Evaluation of a New Independent Software Tool (siMPle) for Spectroscopic Analysis. Applied Spectroscopy 74(9), 1127-1138. https://doi.org/10.1177/0003702820917760.

[8] Hufnagl, B., Steiner, D., Renner, E., Löder, M.G.J., Laforsch, C., Lohninger, H. 2019. A methodology for the fast identification and monitoring of microplastics in environmental samples using random decision forest classifiers. Analytical Methods;11(17):2277–85. https://doi.org/10.1039/C9AY00252A.

[9] Hufnagl, B., Stibi, M., Martirosyan, H., Wilczek, U., Möller, J. N., Löder, M. G. J., Laforsch, C. and Lohninger, H. 2022. Computer-Assisted Analysis of Microplastics in Environmental Samples Based on μFTIR Imaging in Combination with Machine Learning. Environmental Science & Technology Letters 9(1): 90-95.

[10] Moses, S.R., Roscher, L., Primpke, S., Hufnagl, B., Löder, M.G.J., Gerdts, G. and Laforsch, C. 2023. Comparison of two rapid automated analysis tools for large FTIR microplastic datasets. Analytical and Bioanalytical Chemistry. https://doi.org/ 10.1007/s00216-023-04630-w

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