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Probenvorbereitung Automatisierte Aufreinigung von Nukleinsäuren über Magnetpartikel

Autor / Redakteur: Tanja Lopez* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Die Methoden zur Probenvorbereitung können die Ergebnisqualität und Analysenzeit von molekularbiologischen Untersuchungen entscheidend beeinflussen. Derzeit kommen bei der Aufreinigung von Nukleinsäuren aus biologischen Matrices größtenteils zeit- und arbeitsaufwändige manuelle Methoden zum Einsatz. Neue Walkaway-Verfahren nutzen Magnetpartikel und erlauben einen hohen Probendurchsatz bei reproduzierbaren Ergebnissen und niedrigen Kosten.

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Abb. 1 Aufreinigung von Nukleinsäuren über Magnetpartikel: In etwa 30 Minuten reinigt das Maxwell-System bis zu 16 Proben vollautomatisch.
Abb. 1 Aufreinigung von Nukleinsäuren über Magnetpartikel: In etwa 30 Minuten reinigt das Maxwell-System bis zu 16 Proben vollautomatisch.
( Archiv: Vogel Business Media )

Die Nukleinsäureaufreinigung gehört zu den Standardmethoden in der Molekularbiologie und bildet die Vorraussetzung für viele Applikationen in der Genomforschung. Pro Jahr geben rund 45 000 Forschungseinrichtungen weltweit knapp drei Milliarden Euro im Bereich der molekularbiologischen Forschung aus. Allein 450 Millionen Euro davon entfallen auf die Probenaufreinigung.

Die Nukleinsäureaufreinigung hat den größten Stellenwert. 2007 werden dafür schätzungsweise 310 Millionen Euro ausgegeben. Mit 70 Prozent ist die DNA das begehrtere Aufreinigungsobjekt, auf RNA entfallen die verbleibenden 30 Prozent.

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Die isolierten Nukleinsäuren müssen je nach Anwendung hohen Anforderungen genügen. Die Reinheit und Ausbeute entscheidet oft über die Umsetzbarkeit einer Folgeapplikation und bestimmt die Qualität des Endergebnisses der Forschungstätigkeit. Bisher werden in den Labors noch ca. 70 Prozent aller Nukleinsäureaufreinigungen manuell durchgeführt. Automatisierte Gerätelösungen gewinnen allerdings zunehmend an Bedeutung. Neben der Zeit-ersparnis gewährleisten sie gleichbleibende Qualität und sorgen für reproduzierbare Ergebnisse.

Das Maxwell-16-System

Das neue automatisierte Maxwell-16-System von Promega bietet Anwendern die Möglichkeit, Nukleinsäuren auch aus komplexen Martices mit hoher Ausbeute und Konzentration schnell und vollautomatisch in einem Multiwell-Format zu isolieren (s. Abb. 1). Bis zu 16 Proben lassen sich in etwa 30 Minuten parallel bearbeiten und in einem Endvolumen von 30 bis 100 µl oder 200 bis 400 µl eluieren. Ein Proteinase-K-Verdau ist nicht notwendig. Mithilfe des Gerätes können genomische und Plasmid-DNA, RNA, Sequenzier- und PCR-Produkte und HisTag-Proteine gereinigt werden.

Technologie basiert auf Magnetpartikeln

Das System besteht aus dem vorprogrammierten Gerät und vorgefüllten Reagenzienkartuschen, die alle erforderlichen Reagenzien und paramagnetische Magnesil-Partikel (PMPs) enthalten. Nachdem die PMPs das Ausgangsmaterial gebunden haben, transferiert ein magnetischer Stößel die Probenkomplexe in die einzelnen Kartuschen zur Lyse und Reinigung (s. Abb. 2). Manuelle Pipettier- und Zentrifugationsschritte entfallen dadurch komplett. Für jedes Probenmaterial wurde ein individuelles Protokoll entwickelt, um eine effektive Reinigung bei hoher Ausbeute erzielen zu können. Das Protokoll zur Reinigung genomischer DNA aus Gewebe, Blut oder Zellen enthält z.B. einen Schritt, in dem Gewebeproben mithilfe der Stößel-Technik direkt im Lysepuffer zerkleinert werden. Bei der Reinigung von RNA entfernt ein neues Reinigungsagens die störende genomische DNA ebenfalls während der Lyse, eine DNase-Behandlung ist somit nicht notwendig.

Das Gerät ist einfach zu bedienen und nimmt auf der Laborbank nur den Platz eines aufgeklappten Laptops ein. Kreuz-Kontaminationen wurden bisher nicht nachgewiesen. Das Maxwell-16-Sytem wurde auf der Grundlage eines ISO13485:2003-zertifizierten Systems erstellt und entspricht dem internationalen Qualitätsstandard der Medizin-Branche.

Automatisierte Probenvorbereitung mit breitem Applikationsspektrum

Basierend auf den verschiedenen Protokollen lassen sich DNA und RNA sowohl aus forensischen Proben, Bakterien, Pflanzengewebe, Mausschwanz, Zecken und Pilzen als auch aus Hope-Gewebe, LGAs oder Viren reinigen.

Die Isolierung von DNA aus Blutproben beispielsweise ist der erste Schritt einer PCR-Routinediagnostik. Dieser Schritt ist zeit- und arbeitsintensiv und vom ständigen Risiko eines Pipettierfehlers überschattet. Für Blut-, Gewebe- oder Buffy-Coat (Lymphozytenkonzentrat-)Proben existieren jeweils vollautomatisierte Programme. Da der gesamte Prozess ohne manuellen Eingriff erfolgt, ist eine Verwechslung der Proben ausgeschlossen. Abbildung 3 zeigt typische Ausbeuten von Gesamtblut und Buffy-Coat aus Patientenproben.

Unterstützt Probenaufbereitung für die Transplantationsdiagnostik

Das System unterstützt alle DNA-basierten Anwendungen. So auch die Probenaufbereitung für humane Transplantationstests zur Bestimmung des geeigneten Organspenders in HLA-Laboren (HLA, humane Leukozyten-Antigene). Da Transplantationen nur mit lebensfähigen Organen durchgeführt werden können, benötigen klinische HLA-Labore die Ergebnisse von Transplantationstests möglichst schnell. In dieser Applikation hat sich das Maxwell-16-System in kurzer Zeit etabliert. Für die Untersuchungen dienen bis zu 400 µl Blut oder 500 µl Buffy-Coat als Ausgangsmaterial. „Wir unterstützen HLA-Transplantationslabore bei ihrer lebensrettenden Arbeit, indem wir ein Reinigungsverfahren anbieten, das schneller und präziser ist als herkömmliche Anwendungen“, erläutert Tanja Lopez, Produktmanagerin Nukleinsäureaufreinigung bei Promega. „Klinische Labore sollten Zugang zu bezahlbaren automatisierten Anwendungen haben, die zuverlässige Ergebnisse in möglichst kurzer Zeit erbringen.“ Sandra Ott-Gebauer, MTA in der Abteilung Kardiologie und Pneumologie am Universitätsklinikum der Georg-August-Universität, Göttingen ergänzt: „Das Maxwell-16-System ist eine große Hilfe bei der schnellen und zuverlässigen Aufreinigung von DNA und RNA. Das leichte Handling des Gerätes und die selbsterklärende Menüführung machen es auch unseren Studenten sehr viel einfacher.“ Die Applikation für HLA-Labore hat Promega aufgrund der aktuellen Bedürfnisse im Markt entwickelt. Die Maxwell-Technologie ist so flexibel, dass weitere an den Markt angepasste Anwendungen folgen.

* T. Lopez, Promega GmbH, 68199 Mannheim

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