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Harnanalyse Automatisierte Hydrolyse optimiert die Harnanalyse

Autor / Redakteur: GUIDO DEUßING* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Die LC-MS/MS erweist sich als wertvolles und effizientes Instrument bei der Bestimmung von Stoffwechselprodukten. Optimierungspotenzial findet sich allerdings in der Probenvorbereitung. Wissenschaftler haben dies nun für die automatisierte Urinanalyse überaus effektiv umgesetzt.

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Abb.1: Urinproben, behandelt mit unterschiedlichen Beta-Glucuronidase-Enzymen: Helix-Pomatia (a), Albalone (b) und rekombinantes Protein (c). Das von Oscar G. Cabrices und Kollegen gewählte Enzym (c) ermöglichte die Injektion der Proben gemäß der „Prep-and-Shoot“-Vorgabe, ohne sie unmittelbar vorher noch einmal zentrifugieren zu müssen.
Abb.1: Urinproben, behandelt mit unterschiedlichen Beta-Glucuronidase-Enzymen: Helix-Pomatia (a), Albalone (b) und rekombinantes Protein (c). Das von Oscar G. Cabrices und Kollegen gewählte Enzym (c) ermöglichte die Injektion der Proben gemäß der „Prep-and-Shoot“-Vorgabe, ohne sie unmittelbar vorher noch einmal zentrifugieren zu müssen.
(Bild: Gerstel)

Die Harnblase erweist sich als Sammelbecken einer Vielzahl physiologisch interessanter Information, die Rückschlüsse auf Prozesse im Körperinnern zulassen. Bereits im Altertum versuchten die Ärzte durch die als Harnschau bezeichnete Urinbetrachtung Aufschluss zu erlangen, über eine „unharmonische Mischung der Körpersäfte Schleim, Blut, gelbe und schwarze Galle, auf die man zur damaligen Zeit jede innere Erkrankung zurückführte“ [1]. Die Sachlage ist, wie man mittlerweile weiß, komplizierter.

Wie Nährstoffe werden Medikamente, Toxine, Drogen oder Dopingmittel, die man dem Organismus zuführt, metabolisiert, sprich: umgewandelt und bioverfügbar gemacht. Im Zuge dessen fallen Abbauprodukte an, die ihrer unpolaren bzw. lipophilen Molekülstruktur wegen nicht hinreichend wasserlöslich sind und folglich nicht mit dem Harn oder Stuhl aus dem Körper ausgeschieden werden können. Eine Akkumulation dieser Stoffe würde Lebensgefahr bedeuten.

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Dass es soweit nicht kommt, dafür sorgt die Leber. Sie ist zur Biotransformation schwer wasserlöslicher Verbindungen in der Lage. Toxine, Arzneimittel-, Drogen- und Dopingwirkstoffe sowie auch körpereigene Verbindungen wie die Steroidhormone oder das Bilirubin – sie alle werden in der Leber enzymatisch katalysiert durch Bindung an Glucuronsäure zu Glucuroniden umgewandelt; die Konjugate sind wasserlöslich und lassen sich über Galle und Niere ausscheiden.

Hydrolyse der Konjugate erforderlich

Um herauszufinden, etwa im Rahmen pharmakokinetischer Studien, auf welche Weise der menschliche Organismus Arzneimittel oder Drogen umwandelt und abbaut, sind sowohl die im Urin vorliegenden freien Verbindungen als auch deren biotransformierte wasserlösliche Konjugate zu bestimmen. Üblich und weit verbreitet ist die enzymatische Hydrolyse der Konjugate in ihre Ausgangsform, deren Gesamtmenge im Anschluss erfasst wird und Aufschluss bietet. Ähnlich verfährt man im forensisch-toxikologischen Labor bei der Untersuchung einer möglichen länger währenden Drogenintoxikation. Der als enzymatische Hydrolyse bezeichnete Schritt ist, so man ihn manuell ausführt, durchaus arbeits- und zeitintensiv, beinhaltet er doch herkömmlicherweise neben der Hydrolyse zahlreiche Arbeitsschritte wie Dosieren von Lösungen, Zentrifugieren der Probe, Aufreinigen der Extrakte, Anreichern der Analyten bis zur Injektion der Probe ins LC-MS/MS-System. Um die Effizienz der Analyse und den Probendurchsatz zu steigern sowie die Zahl möglicher Fehlerquellen zu minimieren und das Berichtswesen zu verbessern, empfehlen Experten, die Hydrolyse zu automatisieren. Ebendies haben Applikationsexperten um Oscar G. Cabrices von der Firma Gerstel getan [2].

Ziel sei es gewesen, berichtet Oscar Cabrices, für den quantitativen HPLC-MS/MS-Nachweis einer Vielzahl unterschiedlicher Drogen- und Medikamentenwirkstoffe wie Opiate, Opioide, Benzodiazepine, Muskelrelaxantien und Halluzinogene eine vollständig automatisierte „Prep-and-Shoot“-Methode zu entwickeln, die es erlaube, „Urinproben innerhalb kurzer Zeit im Rahmen eines einzigen Arbeitsablaufs schnell und einfach zu behandeln und unmittelbar zu analysieren“.

Automatisierung steigert Analyseneffizienz

Methodenentwicklung und Analyse erfolgten auf einer LC-MS/MS-Kombination bestehend aus einem Agilent 1260-HPLC-System in Kombination mit einem AB-Sciex-Massenspektrometer Qtrap 4500, das sich bauartbedingt als sehr robust und sensitiv bei der Analyse biologischer Matrices erweise und gleichzeitig eine einfache „Prep-and-Shoot“-Vorgehensweise mit hohem Probendurchsatz erlaube, sagt Gerstel-Mitarbeiter Cabrices. Die Automatisierung von Probenvorbereitung und Probenaufgabe wurde auf einem Multi-Purpose-Sampler (MPS) realisiert, der mit einer 96er-Wellplatten-Inkubationsstation ausgestattet war. Sofern die Applikation den Einsatz anderer Probenaufreinigungs- und Anreicherungstechniken wie der Festphasenextraktion (SPE) notwendig machen, lässt sich das Leistungsspektrum des MPS individuell erweitern. Die Proben wurden über ein 6-Port-Injektionsventil aufgegeben, das mit einer 2-µL-Probenschleife aus Edelstahl ausgestattet war. Bei der Trennsäule handelte es sich um eine Phenomenex Kinetex Biphenyl (50 x 4,6 mm, 2,6 µm, 100 Å) mit einer Biphenyl Security Guard Ultra (4,6 mm ID) Vorsäule, die sich in der Anwendung als robust herausgestellt haben.

Für ihre Methodenentwicklung verwendeten Cabrices und Kollegen Stammlösungen von u.a. acht Glucuronidkonjugaten (Morphin-3-glucuronid, Oxymorphonglucuronid, Codein-6-glucuronid, Tapentadolglucuronid, Buprenorphinglucuronid, Lorazepamglucuronid und THC-COOH-Glucuronid) sowie einer Auswahl deuterierter Analoga unterschiedlicher Drogenklassen angesetzt in Methanol. Blank-Urinproben stammten von einem männlichen Freiwilligen, mit bekannten Analyten dotierte von einem forensisch-toxikologischen Labor. Die enzymatische Hydrolyse der Analyten erfolgte in einer Pufferlösung unter Einsatz von β-Glucuronidase, gewonnen aus rekombinanten Proteinen. Mit diesem Enzym habe man, wie Vergleichsuntersuchungen gezeigt hätten, die besten Umsätze erzielt, sagt Cabrices. Zudem hätten die Applikationsexperten die Injektion in das LC-MS/MS-System – anders als bislang üblich – ohne vorangeschaltetes Zentrifugieren durchführen können. Und so gingen die Applikationsexperten vor: Die Urinproben wurden vor der Analyse unter Verwendung einer Zentrifuge von störenden Partikeln befreit. Wellplatten und die Mischung aus Enzym, Hydrolysepuffer und internem Standard wurden auf dem MPS platziert. Alle weiteren Schritte, angefangen beim Mischen der Urinproben mit Enzym, Puffer und Internem Standard, anschließender 15-minütiger Inkubation und Verdünnung der hydrolysierten Probe bis zur Injektion von 2 µL der Probe in das LC-MS/MS-System erfolgten schlussendlich vollständig automatisiert.

Methode erfolgreich in die Praxis umgesetzt

Wie Cabrices und Kollegen berichten, haben sie die Entwicklung ihrer „Prep-and-Shoot“-Methode zur automatisierten Hydrolyse und quantitativen Bestimmung von Arzneimitteln und Drogen in Urin erfolgreich abgeschlossen und in die Laborroutine überführt. Ihre Methode zeichne ein schneller und einfacher Arbeitsablauf und eine hohe Robustheit und Sensitivität sowie ein hoher Durchsatz von mehr als 200 Proben in 24 h aus. Die Mischung von Hydrolysepuffer, internem Standard und β-Glucuronidase wurde optimiert, um die automatisierte Urinhydrolyse ausführen zu können, mit dem Ergebnis einer sehr guten Hydrolyseleistung bei einer Inkubationszeit von nur 15 min. Bei den Glucuroniden habe die Hydrolyseleistung zwischen 94,4 % (THC-COOH-Glucuronid) und 99,7 % (Morphin-3-glucuronid) gelegen. Ferner habe es die Kombination der LC-MS/MS-Analysebedingungen, ultrareiner β-Glucuronidase und dem Design der Ionisierungsquelle des Massenspektrometers möglich gemacht, mehr als 960 Urinproben automatisch zu hydrolysieren, zu verdünnen, zu injizieren und zu analysieren, ohne die analytische Säule zu ersetzen.

Literatur

[1] Die Geschichte der Medizin. Bernt Karger-Decker (2001) 354

[2] O. G. Cabrices, F. D. Forster, A. M. Taylor, L.A. Lee. „Prep-and-Shoot: The Completely Automated Workflow for the Hydrolysis and Anaysis of Urine Samples by LC-MS/MS. GERSTEL AppNote 4/2014 (http://www.gerstel.de/pdf/p-lc-an-2014-04.pdf)

* G. DEUßING: Redaktionsbüro G. Deußing, 41464 Neuss

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