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Durchflusszytometrie Bakterielle Biokunststoffproduktion durchflusszytometrisch verfolgt

Autor / Redakteur: Manfred Zinn*, Stephanie Karmann*, Aldo Vaccari**, Michael Sequeira** und Stéphanie Follonier* / Dr. Ilka Ottleben

In den letzten Jahren sind die Durchflusszytometriegeräte günstiger in der Anschaffung aber auch gleichzeitig leistungsstärker in der Analyse von Bakterien geworden. Im Europäischen Forschungsprojekt SYNPOL untersuchen Wissenschaftler so die bakterielle Biokunststoffproduktion aus Synthesegas während des Bioprozesses im Bioreaktor.

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Abb. 1: Mit Nilrot gefärbte Zelle Rhodospirillum rubrum mit dem Fluoreszenzmikroskop beobachtet (Vergrößerung 100x).
Abb. 1: Mit Nilrot gefärbte Zelle Rhodospirillum rubrum mit dem Fluoreszenzmikroskop beobachtet (Vergrößerung 100x).
(Bild: S. Karmann, HES-SO Valais - Wallis)

Der Bedarf an umweltfreundlichen Kunststoffmaterialien ist in den letzten zehn Jahren enorm gestiegen, die weltweite Produktion von rund 1,4 Mio t (für das Jahr 2012, http://en.european-bioplastics.org/) kann diesen Markt jedoch nicht in genügender Menge und kostengünstig beliefern. Zurzeit sind zwei Hauptklassen von Biokunststoffen auf dem Markt erhältlich: biobasierte/nicht abbaubare und biologisch abbaubare Kunststoffe. Vorteil der biobasierten Kunststoffe wie Bio-Propylen ist, dass sie aus nachhaltigen Ressourcen produziert werden und die industrielle Verarbeitung wegen des erdölbasierten und ansonsten identischen Polymers Polypropylen bereits gut etabliert ist.

Der zu Polypropylen entsprechende und biologisch abbaubare Kunststoff ist Poly ([R]-3-hydroxybutyrat) (PHB) und wird wegen der enantiomeren Reinheit und des hohen Molekulargewichtes (Mw > 600 kDa) ausschließlich biotechnologisch im bakteriellen Bioprozess hergestellt. Dabei lagern die Zellen das PHB als Kohlen- und Energiespeicherstoff im Zellinnern ein, welches mit hydrophoben Färbemitteln, wie Sudan schwarz oder dem Fluorszenzfarbstoff Nilrot (s. Abb. 1), im Mikroskop visualisiert werden kann. Der Gehalt von PHB kann im Bakterium bis zu 90 % der Trockenmasse betragen, wenn Glukose als C-Quelle und eine Wachstumslimitation durch das Nährstoffelement Stickstoff oder Phosphor vorliegt. Mittels Lösemittelextraktion kann PHB aufgereinigt und als Verpackungsmaterial oder sogar medizinisch biokompatibler Werkstoff verwendet werden [1].

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Nachhaltige PHB-Produktion

Um die Biokunststoff-Herstellung von der Lebensmittelproduktion zu entkoppeln und damit einen Konflikt um Rohstoffe zu vermeiden, wurde in den letzten Jahren vermehrt nach alternativen Kohlenstoffquellen gesucht. Die Verwertung von Abfallstoffen aus der Lebensmittelindustrie (z.B. Abfälle aus der Fleisch- und Milchindustrie) stellen dabei eine sehr interessante Alternative dar [2]. Mit geeigneter enzymatischer und/oder chemischer Vorbehandlung werden diese Abfälle zu gut verwertbaren Kohlenstoffquellen, darunter Fettsäuren und Zucker. Der zusätzliche Aufbereitungsschritt bewirkt jedoch gleichzeitig höhere Herstellungskosten.

Syngas als Kohlenstoffquelle

Ein interessanter Ansatz wird im europäischen Forschungsprojekt SYNPOL (FP7, s. Abb. 2) verfolgt. Im Rahmen der europäischen Energiediskussion ist die Verwertung von organischen Abfällen zu Synthesegas ein wichtiges Forschungsprojekt der Industrie geworden. Synthesegas oder auch Syngas genannt, wird bei der thermischen Umwandlung von organischen Materialien bei ca. 600-900 °C in CO, H2, CO2, N2 und Spuren anderer Gase umgewandelt [3]. Syngas wurde bereits in den 1930er Jahren zur energetischen Verwertung benutzt und gilt heute als ein grüner Energiespeicher und auch wertvoller Ausgangsstoff für die chemische Synthese. Wegen des relativ hohen CO-Anteils von 30-40 % führt die thermische Verwertung wiederum zur unerwünschten Bildung von CO2. Hier setzt das EU-Forschungsprojekt Synpol (www.synpol.org) unter der Leitung von Prof. J. L. Garcìa am Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) in Madrid an: Das gebildete CO soll mittels Fermentation von Clostridien (Universität Ulm, Deutschland) in wertvolle Polymerbausteine umgewandelt werden bzw. PHB soll mittels Rhodospirillum rubrum (CSIC und HES-SO Valais – Wallis, Schweiz) direkt oder nach genetischer Rekombination in Ralstonia eutropha (Westfälische Wilhelms-Universität Münster, Deutschland) indirekt hergestellt werden. An der Hochschule für Ingenieurwissenschaften mit Standort Sitten, Schweiz (HES-SO Valais – Wallis) wurde in Zusammenarbeit mit dem Synpol-Industriepartner Infors HT (Bottmingen, Schweiz) eine sichere und moderne Fermentationsplattform zur anaeroben Verwertung von Syngas aufgebaut (s. Abb. 3). Diese Plattform wird zurzeit mit Process Analytical Technology (PAT) ergänzt, unter anderem auch die automatisierte Analyse des PHB-Gehaltes mittels Durchflusszytometrie.

Durchflusszytometrie

Seit den 1970er Jahren hat die Durchflusszytometrie große Entwicklungsschritte bezüglich ihrer Lasertechnologie und Durchflusszelle erzielt. Die Geräte sind kleiner, kostengünstiger und anwendungsfreundlicher geworden. So konnten die sehr gut etablierten Anwendungen im Medizinbereich (z.B. Immunologie, Hämatologie) mit der Entwicklung neuer Fluoreszenzfarbstoffe und Lichtfilter auf die Analyse von Mikroorganismen adaptiert werden. Im Lebensmittelsektor und neuerdings auch in der Trinkwasseraufarbeitung, hat die Durchflusszytometrie unterdessen ihren festen Platz gefunden [4]. Die industrielle Anwendung der Durchflusszytometrie in der Produktion von PHB ist jedoch noch nicht etabliert. Erste Ansätze wurden in den frühen 1980er Jahren mit Nilrot als lipophiler Fluoreszenzfarbstoff durchgeführt [5]. Starke Hintergrundfärbung, schnelles Ausbleichen und die relativ lange Färbezeit erschwerten die Handhabung im Forschungslabor. Erst mit der Verwendung des Fluoreszenzfarbstoffes BODIPY 493/503 konnte die Färbung verbessert und die Fluoreszenzsignale eindeutig für die Quantifizierung des PHB-Gehaltes in der Zelle benutzt werden [6]. Diese PHB-Analysemethode bietet für die Syngas-Fermentation mit R. rubrum entscheidende Vorteile: Die Messresultate sind noch während der Fermentation, sogar beinahe in Echtzeit, verfügbar und es werden nur kleine Probenvolumina (0,5 mL mit optimal 106 Zellen mL-1) benötigt. Diese Vorteile sind umso wichtiger, da eine erste Fermentation gezeigt hatte, dass eine Batchkultur mehr als eine Woche in Anspruch nehmen kann. Die gut etablierte Analyse des PHB-Gehaltes von gefriergetrockneten Bakterien mittels Gaschromatografie ist sehr arbeitsaufwändig, benötigt mindestens 50 mg Biomasse und dauert in der Regel bis zu fünf Tage bis zur vollständigen Auswertung. Da die Zellkonzentration zu Beginn von Batchkulturen sehr niedrig ist, wird ein größeres Probenvolumen benötigt. Daher wird im Synpolprojekt eine volle Automatisierung der PHB-Quantifizierung mittels Durchflusszytometrie angestrebt, auch um die Probenmenge möglichst klein zu halten und den Bioprozess auch während der Randzeiten verfolgen zu können.

Automatisiert und online

Für die Online-Durchflusszytometrie gibt es bereits Geräte auf dem Markt, die für die Qualitätskontrolle von Trinkwasser vorgesehen sind. Stichproben des Wassers werden automatisch entnommen, mit Fluoreszenzfarbstoff gefärbt und die Zellzahl bestimmt [4]. Da diese Geräte jedoch nur Zellzahlen zwischen 102 und 106 Zellen mL-1 korrekt messen können, muss für die Verfolgung der PHB-Produktion – speziell für Bioprozesse mit hohen und stets zunehmenden Zelldichten – ebenfalls eine flexible, automatische Verdünnung bis zu einem Faktor 1000 etabliert werden. Verschiedene Ansätze basieren auf dem grafischen Programmiersystem Labview (National Instruments), das die einfache Modifikation der Verdünnungs- und Färbeschritte erlaubt. Messintervalle von 15 Minuten sind gut realisierbar [7,8]. Zurzeit wird an der HES-SO ein neues Analysesystem entwickelt, das die Messzeit weiter reduzieren soll. Im Rahmen des Synpol-Projektes wird das Online-Durchflusszytometer für die Wahl des optimalen Fermentationsprozesses (Fed-Batch oder Chemostat) und der entsprechenden Mediumsoptimierung eingesetzt werden.

Literatur

[1] Zinn M, Witholt B, Egli T: Occurrence, synthesis and medical application of bacterial polyhydroxyalkanoate. Advanced Drug Delivery Reviews (2001) 53(1):5-21.

[2] Koller M, Bona R, Braunegg G, Hermann C, Horvat P, Kroutil M, Martinz J, Neto J, Pereira L, Varila P: Production of polyhydroxyalkanoates from agricultural waste and surplus materials. Biomacromolecules (2005) 6(2):561-565.

[3] Rostrup-Nielsen JR: New aspects of syngas production and use. Catalysis Today (2000) 63(2–4):159-164.

[4] Hammes F, Salhi E, Köster O, Kaiser H-P, Egli T, von Gunten U: Mechanistic and kinetic evaluation of organic disinfection by-product and assimilable organic carbon (aoc) formation during the ozonation of drinking water. Water Research (2006) 40(12):2275-2286.

[5] Srienc F, Arnold B, Bailey JE: Characterization of intracellular accumulation of poly-β-hydroxybutyrate (phb) in individual cells of Alcaligenes eutrophus h16 by flow cytometry. Biotechnology and Bioengineering (1984) 26(8):982-987.

[6] Kacmar J, Carlson R, Balogh SJ, Srienc F: Staining and quantification of poly-3-hydroxybutyrate in Saccharomyces cerevisiae and Cupriavidus necator cell populations using automated flow cytometry. Cytometry Part A (2006) 69A(1):27-35.

[7] Broger T, Odermatt RP, Huber P, Sonnleitner B: Real-time on-line flow cytometry for bioprocess monitoring. Journal of Biotechnology (2011) 154(4):240-247.

[8] Abu-Absi NR, Zamamiri A, Kacmar J, Balogh SJ, Srienc F: Automated flow cytometry for acquisition of time-dependent population data. Cytometry Part A (2003) 51A(2):87-96.

* Prof. Dr. M. Zinn, S. Karmann, Dr. S. Follonier: HES-SO Valais – Wallis, Institut für Life Technologies, CH-1950 Sion, Schweiz

* *A. Vaccari, M. Sequeira: HES-SO Valais – Wallis, Institut für Systems Engineering, CH-1950 Sion, Schweiz

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