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Neues RT-PCR-Verfahren Covid-19: Schnelle SARS-CoV-2-Diagnostik aus unprozessiertem Patientenmaterial

| Autor / Redakteur: Johannes Kuiper, Timo Baade und Prof. Dr. Christof R. Hauck* / Dr. Ilka Ottleben

Eine frühe Identifikation und Isolierung von Infizierten ist ausschlaggebend für ein erfolgreiches Eindämmen der Coronavirus-Pandemie. Bei einem neuen RT-PCR-Verfahren kann auf die bisher im Rahmen der Diagnostik notwendige, zeit- und kostenaufwändige Aufreinigung der viralen SARS-CoV-2-RNA verzichtet werden.

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Abb. 1: Probenaufbereitung von Covid-19-Verdachtsfällen an der Universität Konstanz
Abb. 1: Probenaufbereitung von Covid-19-Verdachtsfällen an der Universität Konstanz
(Bild: Universität Konstanz)

Die aktuelle SARS-CoV-2 Pandemie hat Gesundheitssysteme und Nationen weltweit einem Stresstest unterzogen. Unter dem Eindruck des rasanten Verlaufs der Pandemie und dem unvorhergesehenen hohen Bedarf an Virusdiagnostik sind gängige Praktiken und etablierte Abläufe an ihre Grenzen gestoßen. So auch in Konstanz, wo die vorhandenen Testkapazitäten, trotz (oder vielleicht gerade wegen) der modernen automatisierten Infrastruktur die hohe Nachfrage nach Tests nicht abbilden konnte (s. Abb. 1).

So trivial es klingt, aber ein Grund war der mangelnde Nachschub an geeigneten Reagenzien zur Isolierung von viraler RNA aus Patientenproben mithilfe von Liquid-Handling-Robotern. Aber muss denn für eine erfolgreiche diagnostische qPCR auf Covid-19 zunächst immer die RNA isoliert werden oder gibt es Alternativen?

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Die quantitative Polymerasekettenreaktion (qPCR) ist der diagnostische Goldstandard für den Nachweis einer akuten viralen Infektion. Das hat einen guten Grund, denn die qPCR ist sehr robust, äußerst sensitiv und relativ schnell. Für eine erfolgreiche Diagnostik muss nur die DNA- bzw. RNA-Sequenz des Erregers bekannt sein. Allerdings benötigt die Analyse eines RNA-Virus wie SARS-CoV-2 einiges an Probenvorbereitung.

In zwei Arbeitsschritten wird zunächst die RNA des Virus isoliert und aufgereinigt und anschließend enzymatisch von RNA in DNA umgewandelt. Denn die gängigen kommerziell verfügbaren Polymerasen können RNA als Vorlage für eine effiziente PCR nicht nutzen. Diese Vorbereitung ist für gewöhnlich zeit- und materialintensiv, erfordert mehrere Schritte der Handhabung sowie den Transfer zwischen mehreren Reaktionsgefäßen. Dies erhöht die Fehleranfälligkeit und die Gefahr einer Kreuzkontamination.

Als sich das Virus immer weiter global verbreitete, allerorten Covid-19-Testzentren eingerichtet wurden und auch viele Forschungslabore sich auf den neuen Erreger fokussierten, kam es fast zeitgleich zum Ausfall von wichtigen Produzenten und Lieferketten, sodass es vielerorts zu Engpässen bei Verbrauchsmaterialien und Reagenzien für die RNA-Isolierung kam. Dies behinderte in den meisten Ländern flächendeckende Tests. Auch die Vorgabe nur symptomatische Verdachtsfälle zu testen, trug, nach allem was bisher bekannt ist, mit dazu bei, dass sich das Virus so schnell verbreiten konnte. Dies alles sind Gründe, warum nach wie vor ein großes Interesse an schnelleren, kostengünstigeren und materialsparenden Alternativen besteht, um eine Infektion mit SARS-CoV-2 nachzuweisen.

SARS-CoV-2-Nachweis: Es geht auch ohne RNA-Isolation

Eine interdisziplinäre Kooperation zwischen dem Lehrstuhl für Zellbiologie an der Universität Konstanz, dem Start-up-Unternehmen MyPOLS GmbH sowie dem Klinikum Konstanz und dem Diagnostiklabor Dr. Brunner führte nun zu einer neuen Möglichkeit, auf die zeit- und kostenaufwändige Aufreinigung der viralen RNA zu verzichten. Ermöglicht wird diese neue Vorgehensweise durch den Einsatz einer optimierten Polymerase, welche eine Doppelrolle übernimmt: Das Enzym kann sowohl RNA-abhängig arbeiten und das SARS-CoV-2 Erbgut von RNA in DNA umschreiben, als auch sogleich als DNA-Polymerase mit der Vervielfältigung der DNA beginnen.

Ein großer Vorteil der so genannten Volcano-3G-Polymerase ist, wie der Name bereits andeutet, ihre hohe thermische Stabilität. Die Halbwertszeit des Enzyms bei 95 °C liegt bei über 40 Minuten. Dies hat eine Reihe wesentlicher Vorteile. Die Resistenz der Polymerase gegenüber hohen Temperaturen erlaubt einerseits einen Hitze-Denaturierungsschritt, der ausreicht, um die Virenhülle zu zerstören und so die virale RNA freisetzt, ohne die Polymerase negativ zu beeinträchtigen. Des Weiteren helfen hohe Temperaturen dabei, Sekundärstruktur-Elemente in der viralen RNA aufzulösen, und ermöglichen somit ein effizienteres Ablesen der Viren-RNA.

Insbesondere das Genom von Einzelstrang-RNA-Viren besitzt ausgeprägte Sekundärstrukturen, z.B. Pseudoknoten, Loops und Hairpins, die Stolpersteine für Polymerasen darstellen und dazu führen können, dass sich das Enzym vom RNA-Strang löst. Ein effizientes Umschreiben ist so häufig nicht möglich. Beim hier vorgestellten Direktverfahren wird eine Temperatur von 75 °C während der Umschreibungsphase angewandt, wodurch diese Stolpersteine mühelos beseitigt werden.

Die Kehrseite der Medaille: das Ablesen der RNA durch die Volcano-3G-Polymerase ist etwas langsamer, wodurch mehr Zeit für diesen Schritt eingeplant werden muss. Auch ist das Enzym nicht in der Lage, im RNA-Umschreibemodus längere Nukleotidfolgen zu synthetisieren. Für dia­gnostische Ansätze, bei denen meist nur kurze Sequenzen unter 500 Basenpaaren amplifiziert werden, ist die Leistung der Volcano-3G-Polymerase jedoch mehr als ausreichend. Die Temperaturstabilität des Enzyms erlaubt außerdem den Einsatz mehrerer Amplifikationszyklen während der reversen Transkription, also beim Umschreiben der RNA in DNA, wodurch auch spärlich vorhandenes Probenmaterial kein Problem mehr darstellen sollte.

Mit dieser Vorgehensweise lässt sich virale RNA direkt aus dem Abstrichmaterial aus Patienten nachweisen, eine vorherige Aufreinigung der RNA kann entfallen.

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