Das Prinzip Thermocycler: drei Schritte, eine Sequenz

Marktübersicht Thermocylcer Das Prinzip Thermocycler: drei Schritte, eine Sequenz

19.10.2010Autor / Redakteur: Ilka Ottleben* / Dr. Ilka Ottleben

Die PCR ist eine etablierte Methode zur In-Vitro-Amplifikation von Nukleinsäuren. Von den Gerätelösungen fordern Anwender unter anderem Geschwindigkeit, Präzision, Flexibilität und nicht zuletzt auch kleine Standflächen. LaborPraxis hat sich bei den Thermocycler-Herstellern umgesehen und präsentiert in einer Marktübersicht die neuesten Trends und Systeme.

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Die Polymerase-Kettenreaktion (engl. polymerase chain reaction, PCR) gehört zu den bedeutensten Methoden der modernen Biologie: Kaum ein Labor, in dem die Methode nicht eingesetzt wird, um Gene zu klonieren, genetische Fingerabdrücke zu erstellen oder Erbkrankheiten, Virusinfektionen und Verwandtschaftsbeziehungen nachzuweisen. 1983 vom späteren Nobelpreisträger Kary Mullis erfunden, gehört die In-Vitro-Amplifikation von DNA heute für so unterschiedliche Fachrichtungen wie Molekularbiologie, Zellbiologie, Immunologie, Diagnostik, Medizin, Forensik oder Phylogenetik zum Standard.

Dabei ist das Prinzip der PCR erstaunlich einfach: Die drei durch eine bestimmte Temperatur definierten Schritte Denaturierung, Primer-Annealing und Elongation erlauben in zyklischer Wiederholung und unter Verwendung einer hitzestabilen DNA-Polymerase, auch kleinste Mengen doppelsträngiger DNA spezifisch und exponentiell zu vermehren. Weitere Analysen der DNA werden so problemlos möglich. Hat man in den Anfängen die notwendigen Temperaturzyklen noch in drei unterschiedlich beheizten Wasserbädern manuell ausgeführt, so übernehmen heute vollautomatische Thermocycler diese Aufgabe.

Geschwindigkeit, Reproduzierbarkeit und Methodenentwicklung

Das Angebot verschiedener Systeme am Markt erscheint dabei nahezu unendlich – die Wahl des geeigneten Thermocyclers richtet sich daher insbesondere nach den Anforderungen der jeweils einzusetzenden PCR. Ein genereller Trend, der sich durch die Entwicklungsgeschichte der PCR-Technik zieht, ist das Bemühen die Durchlaufgeschwindigkeiten durch die Temperaturprofile ständig zu erhöhen. Begleitet wird dieser Trend in vielen Bereichen durch den Bedarf möglichst kleine Volumina mit einem möglichst hohen Durchsatz einzusetzen. In anderen Anwendungsgebieten ist dagegen maximale Flexibilität entscheidendes Kriterium.

Maßgebend für die Geschwindigkeit einer PCR-Reaktion sind im Wesentlichen die Heiz- bzw. Kühlraten des Gerätes, die Temperaturregelgeschwindigkeiten und die Extensionsraten der eingesetzten DNA-Polymerasen. Thermocycler, die in der konventionellen Endpunkt-PCR eingesetzt werden, verwenden meist Peltier-basierte Heizblöcke aus Materialien wie Aluminium oder Silber. Silberblöcke sind etwas teurer, besitzen aber eine bessere Wärmeleitfähigkeit als vergleichbare aus Aluminium. Oft können kombiniert hierzu, besonders dünnwandige PCR-Gefäße eingesetzt werden. Die meisten heute verfügbaren Thermocycler, erreichen auf diese Weise Heiz- bzw. Kühlraten von 3 bis 5°C pro Sekunde, speziell auf Geschwindigkeit optimierte Systeme sogar 10 bis 15°C pro Sekunde. Viele Amplifikationen gelingen so in deutlich weniger als einer Stunde. Thermocycler müssen jedoch nicht nur schnell heizen und kühlen, sondern die Temperaturen auch schnell stabilisieren und präzise halten. Für Qualität und Reproduzierbarkeit von PCR-Reaktionen sind daher Faktoren wie Temperaturstabilität bzw. Regelgenauigkeit und die Temperatur-Homogenität der Heizblöcke entscheidende Parameter.

Das Erhitzen der Proben führt als Neben-effekt auch zu unerwünschter Verdunstung, der in modernen Thermocyclern durch speziell entwickelte Heizdeckel entgegengewirkt wird.

Laboren, die häufig PCR-Reaktionen mit schwierigen oder unbekannten Templates durchführen, können Thermocycler mit Gradienten-Funktion zu einer nicht unwesentlichen Zeitersparnis verhelfen, da sich PCR-Protokolle auf diese Weise schnell optimieren lassen. Meist wird ein maximaler Gradient von ± 10°C gefahren, um die optimale Annealing-Temperatur der Primer zu ermitteln. Mithilfe der so genannten Touch-Down-PCR lässt sich unspezifisches Anlagern von Primern an die Templates reduzieren. Bei diesem Verfahren wird die Annealingtemperatur von Zyklus zu Zyklus verringert.

Flexibilität durch unterschiedliche Blockformate

Je nach Anwendung können die PCR-Anforderungen von Laboren sehr dynamisch sein. Ausreichende Speicherkapazitäten sind dabei ebenso hilfreich wie die Möglichkeit, Formate und Durchsatz flexibel anpassen zu können. Letzteres bieten Thermocycler mit Wechselblocksystem. Für Hochdurchsatz-PCRs ist die Möglichkeit einer Roboterintegration sinnvoll.

Hier finden Sie eine Marktübersicht zu Herstellern von Thermocyclern, die eine Entscheidungshilfe bei der Wahl des geeigneten Systems bieten soll. Die Unternehmen hatten die Möglichkeit, zwei Systeme aus ihrem Portfolio vorzustellen. Die Übersicht wurde anhand von Selbstauskünften erstellt und erhebt keinen Anspruch auf Vollständigkeit.

*Dr. I. Ottleben, Redaktion LaborPraxis, E-Mail: ilka.ottleben@vogel.de

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