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Assays Den Rand-Effekt in zellbasierten Assays minimieren

Autor / Redakteur: Jessica Wagener* und Christelle Plennevaux** / Dr. Ilka Ottleben

Der so genannte Edge Effect ist gefürchtet, da er die Ergebnisse zellbasierter Assays beeinträchtigt. Eine neue Zellkulturplatte bietet nun zwei Optionen, die äußeren sowie die inneren Wells zu isolieren, was eine gleichmäßige Verteilung von Temperatur und Feuchtigkeit gewährleistet.

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Abb. 1: ...B) Isolierung aller 96 Wells durch Befüllung des gesamten Zwischenraumes
Abb. 1: ...B) Isolierung aller 96 Wells durch Befüllung des gesamten Zwischenraumes
(Bild. Eppendorf)

Die Analyse zellulärer Reaktionen mithilfe zellbasierter Assays gewinnt in nahezu allen Bereichen der biologischen Forschung an Bedeutung. Die Möglichkeit, Assays an Hochdurchsatzverfahren anzupassen, macht diese unentbehrlich. So werden sie z.B. in der pharmazeutischen Forschung eingesetzt, um potenzielle Medikamente zu identifizieren. Die Aussagekraft und der Wert der erhaltenen Daten beruhen auf der gleichbleibend hohen Qualität der durchgeführten Assays. Zahlreiche Gründe können zur Unbeständigkeit in Multi-Well-Platten beitragen, so z.B. Variationen in Zellaussaat und Unterschiede in Zellwachstum und -adhärenz. Einige dieser Aspekte können durch die Optimierung von Routineverfahren im Labor vermieden werden. Mögliche Maßnahmen schließen adäquate Durchmischung und Dissoziierung der Zellen ein, das Vermeiden von Luftblasen während der Zellaussaat sowie die Bestimmung optimaler Wachstumsbedingungen bezüglich der Medienzusammensetzung und Aussaatdichte. Der so genannte Edge Effect kann durch diese Maßnahmen allerdings nur selten vermieden werden. Da Well-zu-Well-Variationen in Assay-Ergebnissen vor allem in den äußeren Wells einer Multi-Well-Platte eine Rolle spielen, wird dieses Phänomen als Randeffekt („Edge Effect“) bezeichnet.

Die Ursachen des Edge Effects sind vielfältig. Temperaturunterschiede innerhalb der Platte und Verdunstungseffekte in den Rand-Wells während der Inkubation wurden als zwei mögliche Faktoren beschrieben, die unregelmäßiges Zellwachstum insbesondere an der Peripherie der Platte zur Folge haben können [1;2]. Es wird allgemein angenommen, dass Verdunstung in den äußeren Wells zu einer Anreicherung von Medienkomponenten (z.B. Salzen) führt, was wiederum den Zellstoffwechsel beeinflusst. Temperaturgradienten können ungleichmäßige zelluläre Reaktionen hervorrufen. Beide Faktoren – Verdunstung und Temperaturgradient – können zu Unregelmäßigkeiten führen sowie zu höheren Varianzen zwischen individuellen Assays, und somit letztendlich zu unzuverlässigen Ergebnissen.

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Methoden zur Vermeidung des Edge Effects

Verschiedene Methoden zur Vermeidung des Edge Effects wurden bereits beschrieben. Ein Ansatz, um die Auswirkungen eines Temperturgradienten zu minimieren, ist die Vorinkubation der Platte mit frisch ausgesäten Zellen für ein bis zwei Stunden bei Raumtemperatur, wodurch gleichmäßigere Zellverteilung und Adhäsion erreicht werden [3]. Allerdings kann sich diese Methode, abhängig vom Zelltyp, auf die Lebensfähigkeit der Zellen auswirken. Für Anwendungen, bei denen langfristige Inkubationen vonnöten sind, stehen verschiedene Produkte, wie Feuchtigkeitskammern und Temperaturkammern, von verschiedenen Anbietern zur Auswahl. Ihr Zweck ist die Erschaffung einer gleichbleibenden Mikroumgebung, indem die Verdunstung reduziert und ein nahezu konstantes Niveau an Feuchtigkeit und Temperatur erreicht wird.

Eine weitere gängige Methode zur Verhinderung des Edge Effects stellt die Vermeidung der peripheren Wells dar, dies allerdings auf Kosten des Probendurchsatzes und der Effizienz. Das Nichtbenutzen der äußeren Wells einer 96-Well-Platte reduziert die Anzahl der verfügbaren Wells auf 60, eine Verminderung des Plattendurchsatzes um 38 %. Dies resultiert in höheren Ausgaben für Einmalartikel, beansprucht mehr Platz im Inkubator und kostet Zeit.

Minimierung des Edge Effects – Zellkulturplatten im Vergleich

Im Folgenden wird eine einfache und zweckmäßige Methode zur Minimierung der Verdunstung durch die Nutzung des äußeren Grabens und des Raumes zwischen den Wells der Eppendorf 96-Well-Zellkulturplatte beschrieben. Dieser Beitrag vergleicht Eppendorf 96-Well-Zellkulturplatten mit 96-Well-Zellkulturplatten anderer Hersteller in Bezug auf Well-zu-Well-Variation und Verdunstung.

  • Vorbereitung der Platten: Zur Beurteilung der Verdunstung in 96-Well-Platten wurden die Eppendorf-Zellkulturplatte sowie drei weitere Wettbewebsplatten untersucht. Der äußere Graben der Eppendorf-Platte wurde mit 1 x 5 mL PBS befüllt. Der innere Raum zwischen den Wells wurde mit 1 x 8 mL PBS befüllt. Die Platte des Herstellers A bietet einen Graben mit vier Reservoirs, die mit Flüssigkeit befüllt werden können. 1,75 mL PBS wurden in jedes der vier Reservoirs gegeben. Die Platten wurden in einem Eppendorf New Brunswick CO2-Inkubator bei 37 °C, 5 % CO2 und entsprechender Luftfeuchtigkeit äquilibriert. Da die Platten der Hersteller B und C keine Möglichkeit bieten, den Raum zwischen den Wells zu befüllen, wurden für diese Platten keinerlei Vorbereitungsschritte durchgeführt.
  • Verdunstungsmessungen: Nach der Äquilibrierung wurde jede Platte unter Benutzung des automatischen Pipettiersystems ep-Motion 5075m mit 200 µL sterilen Wassers pro Well befüllt. Die Platten wurden unter Standardbedingungen (37 °C, 5% CO2, befeuchtete Atmosphäre) inkubiert. Nach fünf Tagen Inkubationszeit wurden die Platten aus dem Inkubator entnommen und für 30 Minuten bei Raumtemperatur äquilibriert. 0,01 %-Kristallviolettlösung wurde zugegeben (20 µL/Well) und durch Resuspendieren vermischt. Daraufhin wurden 100 µL dieser Mischung aus jedem Well in eine Eppendorf Microplate (VIS 96/F) gegeben. Für die Erstellung einer Kalibrierungskurve wurden Kristallviolett-Standards hergestellt. Die Absorption der Proben und der Standards wurde bei 600 nm im Eppendorf Platereader AF2200 gemessen. Dargestellt sind die Mittelwerte aus zwei Messungen.

Flüssigkeitsverluste über die gesamte Platte minimieren

Bei längeren Inkubationszeiten wird das Phänomen der Verdunstung in 96-Well-Platten zu einem kritischen Faktor. Insbesondere in Rand-Wells tritt Flüssigkeitsverlust auf, da diese Wells nicht vollständig von benachbarten Wells umgeben sind. Das Isolieren der Rand-Wells mit Flüssigkeit kann die Verdunstung reduzieren, wie in Tabelle 1 dargestellt. Ohne Isolierung zeigen die äußeren Wells der Eppendorf 96-Well-Zellkulturplatte nach fünftägiger Inkubation unter Zellkultur-Standardbedingungen eine durchschnittliche Verdunstung von nur 1,8 %. Der geringe Flüssigkeitsverlust ist wahrscheinlich auf die optimierte Passgenauigkeit von Deckel und Platte zurückzuführen. Das Befüllen des äußeren Grabens mit Flüssigkeit senkt die Verdunstungsrate auf weniger als 1 %. Wie in Abbildung 1 gezeigt, ermöglicht das „Chimney-Well“-Design der Eppendorf-Platte das zusätzliche Befüllen des Well-Zwischenraumes, was die Verdunstung in den Rand-Wells auf lediglich 0,3 % senkt. Ein weiterer Vorteil der Isolierung jedes einzelnen Wells ist eine langsamere Abkühlung des Mediums in den Wells wenn die Platte außerhalb des Inkubators gehandhabt wird (z.B. beim Mikroskopieren). Jede Flüssigkeit, wie steriles PBS, Wasser oder Zellkulturmedium, eignet sich zum Befüllen des Grabens und des Zwischenraumes. Durch die Konstruktion der Eppendorf-Zellkulturplatte lässt sich der komplette Zwischenraum mit nur einem Pipettierschritt befüllen.

Ein Vergleich verschiedener 96-Well-Zellkulturplatten (s. Abb. 2 und Tabelle 2) zeigt, dass die Eppendorf-Zellkulturplatte die einzige Platte ist, welche die Verdunstung effektiv minimiert. Hersteller A bietet die Möglichkeit einer teilweisen Isolierung der äußeren Wells; allerdings konnte hier nach wie vor ein deutlicher Randeffekt beobachtet werden, wenn auch abgeschwächter, im Vergleich zu Herstellern B und C.

Das Befüllen des gesamten Well-Zwischenraumes der Eppendorf-Zellkulturplatte trägt zu einer homogenen Feuchtigkeitsverteilung und Temperaturstabilität innerhalb der Platte bei. Dies führt zu einer verminderten Verdunstungs- und Kondensationsrate, was den Edge Effect drastisch reduziert.

Literatur

[1] A simple and cost efficient method to avoid unequal evaporation in cellular screening assays, which restores cellular metabolic activity. Walzl A, Kramer N, Mazza G, Rosner M, Falkenhagen D, Hengstschläger M, Schwanzer-Pfeiffer D, Dolznig H.; Int J Appl Sci Technol. 2012 June;2(6)

[2] A pitfall of the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5(3-carboxymethonyphenol)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS) assay due to evaporation in wells on the edge of a 96 well plate. Patel MI, Tuckerman R, Dong Q; Biotechnology Letters 2005; 27:805-808

[3] A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Lundholt BK, Scudder KM, Pagliaro L; Journal of Biomolecular Screening 2003; 8: 566

* J. Wagener: Eppendorf AG, 22339 Hamburg

* *C. Plennevaux: Eppendorf Application Technologies SA, Namur, Belgien

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