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Dynamische Lichtstreuung Der Weg zur perfekten Formulierung

Autor / Redakteur: Dierk Roessner* und Roger Scherrers / Dr. Ilka Ottleben

Zu den kritischen Schritten beim Einsatz von Biopharmazeutika als therapeutische Produkte gehört auch die Entwicklung einer geeigneten Formulierung. Die Dynamische Lichtstreuung bietet eine schnelle Möglichkeit zur Protein-Charakterisierung und ist automatisierbar.

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(Bild: Wyatt)

Der Marktanteil von biotechnologisch hergestellten Arzneimitteln betrug 2010 ca. 20% des Pharmamarktes in Deutschland, wobei monoklonale Antikörper den größten Anteil ausmachten [1]. Die Formulierungsentwicklung ist einer der kritischen Schritte beim Einsatz von Biopharmazeutika als therapeutische Produkte. Ziel der Formulierung ist die Stabilisierung der Proteine bzw. Protein-Komplexe und ihrer oft hochempfindlichen 3D-Struktur durch die Entwicklung eines geeigneten Formulierungspuffers.

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Die Formulierung muss beständig gegenüber physikalischen und chemischen Einflüssen sein. Typische Probleme bei Proteinen in ihrer Darreichungsform sind kovalente und nicht-kovalente Aggregation, Desaminierung, Spaltung, Oxidation sowie Oberflächendenaturierung. Im Zuge der Entwicklung einer erfolgreichen Formulierung wird die Auswirkung verschiedener Hilfsstoffe wie Zucker, Salze, Antioxidationsmittel, Aminosäuren und Detergenzien auf die Stabilität des Produktes optimiert. Da die Kombinationen verschiedener Additive in unterschiedlichen Konzentrationen und Puffern mit verschiedenen pH-Werten untersucht werden, entstehen umfangreiche Testreihen.

Die Routinemethode für Charakterisierung und Quantifizierung von Proteinaggregaten im Rahmen von Formulierungsstudien ist die Größenausschlusschromatographie (SEC/GPC). Diese Methode wird oft mit Mehrwinkel-Lichtstreudetektoren (MALS) gekoppelt, um die Molekülmassen der eluierenden Komponenten absolut zu messen und so Robustheit und Informationsgehalt der Experimente zu optimieren. Die Hauptnachteile der Größenausschlusschromatographie liegen jedoch in der Veränderung der Aggregate durch Verdünnung, Scherung und Interaktion mit der stationären Phase. Auch die Zeit, die pro Messung und für die Gleichgewichtseinstellung nach Wechsel der mobilen Phase erforderlich ist, macht die Verwendung der Größenausschlusschromatographie für ein Screening vieler Proteinlösungen problematisch.

Deshalb werden diese Studien immer öfter mit säulenfreien Methoden wie Asymmetrischer Feldflussfraktionierung (AF4) [2], Hohlfaser-Feldflussfraktionierung (HF5) [3] und Dynamischer Lichtstreuung (DLS) durchgeführt. Dynamische Lichtstreuung bietet im Vergleich zu anderen Methoden die Möglichkeit, Messungen automatisiert und sehr schnell sowie mit geringem Bedarf an Probe in einem Well-Plate durchzuführen. Sie ist daher „High-Throughput“-fähig. Des Weiteren wird die Probe nicht verdünnt und keinen Scherkräften ausgesetzt, was eine mögliche Veränderung durch diese Effekte verhindert. Mittels DLS lassen sich für die Formulierung wichtige Parameter bestimmen, so die Viskosität, die Aggregation, die Löslichkeit sowie die Dissoziationskonstante.

Dynamische Lichtstreuung

DLS-Detektoren messen die zeitabhängige Fluktuation der Streulichtintensität, die durch die Brown‘sche Molekularbewegung verursacht wird (s. Abb. 2). Große Moleküle bewegen sich langsamer durch die Lösung als kleine. Durch die Messung der Fluktuationsänderung (s. Abb. 3) kann die Diffusionskonstante und mithilfe der Stokes-Einstein-Beziehung die Teilchengröße gemessen werden.

Die Messung der Streulichtmenge wird mit einer Avalanche-Photodiode durchgeführt. Diese Diode stellt die für die Dynamische Lichtstreuung erforderliche hohe zeitliche Auflösung von einigen 100 ns zur Verfügung. Die Auswertung erfolgt in einem Autokorrelator, einem Prozessor, der die zeitliche Änderung der Streulichtmenge auswertet. Je größer das Molekül, d.h. je langsamer es diffundiert, desto später tritt das Signal in der Autokorrelationsfunktion (s. Abb. 4) auf.

Der Parameter, der mittels DLS gemessen wird, ist der Diffusionskoeffizient (DT), aus dem der hydrodynamische Radius (Rh) unter Verwendung der Stokes-Einstein-Gleichung berechnet wird. Der hydrodynamische Radius Rh ist der Radius einer Kugel mit dem gleichen Diffusionskoeffizienten wie das gemessene Protein. Daher wird der hydrodynamische Radius auch als Kugeläquivalent-Radius bezeichnet. Die Detektionsgrenzen des hydrodynamischen Radius liegen zwischen 0,3 nm und 1 µm, wobei die untere Grenze durch die im Puffer verwendeten Salze gegeben ist. Die obere Grenze ergibt sich aus der Gravität. Weil die Intensität des Streulichtes proportional zur Molekülmasse ist, ist die Methode hoch empfindlich bei der Detektion kleiner Mengen großer Aggregate.

DLS-Messungen

Moderne Proteinpräparate sind hoch konzentriert und enthalten bis zu 200 mg/mL Protein [6]. Dies bedeutet besondere Herausforderungen für die Analysemethode, da die hohe Konzentration die Viskosität erhöht. Die Viskosität der Proteinlösung muss bei solchen Lösungen bekannt sein, um den hydrodynamischen Radius zu bestimmen. Automatisierte DLS ist ein Verfahren, das die Viskosität dieser Lösungen mittels „tracer particles“ bestimmen kann [7].

Lehermayr et al. [8] konnten zeigen, dass mittels Radien-Messung mit automatisierter DLS auch die Dissoziationskonstante kD, und der zweite Virial-Koeffizienten A2 der Formulierung messbar sind. Die Vorteile der Bestimmung dieser Parameter mittels automatisierter DLS liegen im hohen Automatisierungsgrad, der Geschwindigkeit und der niedrigen benötigten Substanzmenge.

Für die hier vorgestellten Messungen wurde der Wyatt Dynapro Plate Reader eingesetzt. Gemessen wurde in einer 384-Well-Plate. Hierbei handelt es sich um eine industrielle Standardplatte für Plate Reader mit optischen Messmethoden, in der mit einem Volumen von 20 µL pro Kavität gearbeitet wird. Verwendbar sind ebenfalls Well-Plates mit 96 oder 1536 Kavitäten, Standardplatten ebenso wie Low-Volume-Well-Plates. Die Kavitäten werden nur einmal gefüllt, sodass keine Verschleppung (Kreuzkontamination) von Probe auftreten kann.

Bei der hier vorgestellten Probe handelt es sich um einen monoklonalen Antikörper. Die Messungen wurden mit Konzentrationen von 3 bis 10 mg/mL durchgeführt. Als „tracer particles“ für die Messung der Viskosität dienten Polystyrolpartikel mit 50 nm Radius. Da direkt in dem Well-Plate gemessen wird, muss die Probe nicht während des Messvorgangs transportiert werden. Es ist kein Spülen oder Reinigen von Kapillaren und Küvetten erforderlich. Daher entfallen Wartezeiten, die beim Reinigen und manuellen Beschicken von Küvetten auftreten. Durch die so gewonnene Zeit ist es möglich, mehr Proben, die gleiche Probe mehrmals oder auch den reinen Puffer zu messen. Messungen der reinen Polystyrolpartikel ergeben einen hydrodynamischen Radius (Rh) von 50 nm (s. Abb. 5). Bei der Messung der Proteinlösungen erhält man durch den Einfluss der Viskosität der Proteinkonzentrationen Teilchengrößen von 50 bis 63 nm. Aus dem Verhältnis zwischen der erwarteten Teilchengröße und der gemessenen Größe kann somit die tatsächliche Viskosität aus der Stokes-Einstein-Beziehung errechnet werden.

Misst man den hydrodynamischen Radius der reinen Antikörperverdünnungsreihe, so kann man für jede Konzentration die jeweilige Viskosität einsetzen und erhält so die Werte für den hydrodynamischen Radius (s. Abb. 6, laborpraxis.de).

Yadav et al. [9] zeigen, dass man aus der Konzentrationsabhängigkeit des Diffusionskoeffizienten (kD) die Dissoziationskonstante des Proteins messen kann: Dm = Ds + Ds kD C

Hierbei ist Dm der gemessene Diffusionskoeffizient bei verschiedenen Konzentrationen und Ds ist der Diffusionskoeffizient der Probe bei der Konzentration C = 0 mg/ml.

Aus der Steigung ( 2,39*10-8 m2/s) ergibt sich eine Dissoziationskonstante kD von (0,35 mL/g). Aus dieser lässt sich nach Lehermayer et al. mittels folgender Formel der zweite Virialkoeffizient A2 bestimmen: kD = 1,06 A2Mw - 8,9

Hierbei ist Mw die molare Masse des gemessenen Protein-Monomers. Es ergibt sich somit ein A2 von (5,58e-5 mol mL/g2) für den gemessenen Antikörper.

Zusammenfassung

Direkte Messungen für die Viskosität und Messmethoden für die Messung des zweiten Virial-Koeffizienten bedeuteten bisher immer einen hohen Einsatz von Probe und Zeit. Mit der vorgestellten automatisierten Methode ist es möglich, die Messungen in Well-Plates in einer Zeit unter einer Stunde inklusive Pipettieren bei den acht gezeigten Konzentrationen durchzuführen. Hierzu wurden weniger als 100 µL der Antikörperstammlösung mit einer Konzentration von 100 mg/mL verwendet. Dies ist deutlich weniger Probe als die bisher mit traditionellen Messverfahren für die Bestimmung von Viskosität, Aggregation, Löslichkeit und Dissoziationskonstante erforderlich war. Die Messung kann auch in einem 1536-Well-Plate durchgeführt werden. Hierbei kann man das Probenvolumen auf eine Minimalmenge von 1,5 µl je Kavität und damit um ungefähr den Faktor 30 reduzieren. ●

Literatur

[1] www.vfa-bio.de/download/bcg-report-2011-broschuere.pdf.

[2] Litzen A., Wahlund K.G., J. Chromatogr., 1989, 476, 413-421

[3] Johann C., Elsenberg S., Roesch U., Rambaldi D.C., Zattoni A., Reschiglian P., J. Chromatogr., A, 2010, 1016

[4] Wyatt P.J., Instrumentation Science & Technology, 1997, 25(1), 1-18.

[5] Cromwell M.E.M., Hilario E., Jacobson F., The AAPS Journal, 2006, 8(3), E571-579

[6] Harding J, Burtness B., Drugs of Today, 2005, 41(2), 107-127

[7] Feng He, Journal of Pharmaceutical Sciences, 2011, 100(4), 1330-1340.

[8] Lehermayr C., Mahler H.C., Mäder K., Fischer S., J. Pharm. Sci., 2011, 100(7), 2551 2562

[9] Yadav S., Liu J., Shire S.J., Kalonia D.S., J. Pharm. Sci., 2010, 99(3), 1152-1168

* Dr. D. Roessner, Dr. R. Scherrers sind Mitarbeiter der Wyatt Technology Europe, 56307 Dernbach

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