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Imaging MS Die bildgebende Massenspektrometrie auf dem Vormarsch

Autor / Redakteur: Klaus Bollig* / Dr. Ilka Ottleben

Das Verfahren der bildgebenden Massenspektrometrie (Imaging MS) erfasst visuell die Verteilung von Molekülen auf Basis ihrer Masse zu Ladungsverhältnisse. Gerade in letzter Zeit fand diese Technologie durch verschiedenste Anwendungen in Forschung und Entwicklung das Interesse der Fachöffentlichkeit

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Abb. 1: Die Shimadzu Laborwelt in Duisburg
Abb. 1: Die Shimadzu Laborwelt in Duisburg
(Bild: © Dirk Matull Fotografie/Shimadzu)

Überall dort wo Gewebe und bestimmte Analyten darin spezifisch analysiert werden sollen, spielt die bildgebende Massenspektrometrie (Imaging MS) ihre Stärken aus, denn sie erlaubt die Analyse der molekularen Zusammensetzung von Gewebeproben im räumlich-morphologischen Kontext. Die historisch noch recht junge Weiterentwicklung in der Massenspektrometrie erweitert ihr Applikationsspektrum und eröffnet eine neue Dimension bei der Analyse von Geweben wie beispielsweise Tumorgewebe.

Bei der bildgebenden Massenspektrometrie wird die Probe – beispielsweise ein histologischer Gewebeschnitt – an zuvor ausgewählten Stellen in einem Raster massenspektrometrisch analysiert. Eine Software fügt anschließend die einzelnen Massenspektren der untersuchten Stellen zu einem Bild (MS-Image) zusammen; es zeigt die Verteilung einzelner Substanzen in der Probe. Damit lässt sich dann das Auftreten bestimmter Moleküle an bestimmten Orten mit morphologischen Auffälligkeiten vergleichen.

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Das IM Scope Trio (s. Abb. 2) wurde von Shimadzu speziell für die bildgebende Massenspektrometrie konzipiert und kombiniert ein hochauflösendes Massenspektrometer mit einem optischen Mikroskop. Damit lassen sich MS-Bild und mikroskopische Aufnahme übereinanderlegen und vergleichen. Mikroskopisch untersuchte Probensubstanzen werden dadurch direkt identifiziert und auch ihre räumliche Verteilung in einem Gewebe ermittelt.

Auflösung von bis zu 5 µm

Das optische Mikroskop akquiriert Auflicht- und Durchlichtaufnahmen sowie Fluoreszenzaufnahmen mit bis zu fünf verschiedenen Wellenlängen. Mit der MALDI-Technik (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation) werden die Analyten bei atmosphärischem Druck ionisiert. Der dafür eingesetzte Festkörperlaser rastert die Proben mit einem variablen Durchschnitt von 5 bis 200 µm. Mit einer maximalen MS-Bild-Auflösung von 5 µm wird aktuell die weltweit beste Ortsauflösung für kommerziell erhältliche Systeme dieser Art erreicht.

Im integrierten Ionenfallen-Time-of-Flight (IT-TOF)-Massenspektrometer werden anschließend die ionisierten Moleküle analysiert. Weil das hochauflösende Massenspektrometer auch MSn-Analysen durchführen kann, werden die Zielanalyten identifiziert und durch deren Fragmentierung und die Struktur aufgeklärt.

Des Weiteren verbessert die Fragmentierung ausgesuchter Zielverbindungen das Signal-Rausch-Verhältnis und erhöht dadurch zusätzlich die Empfindlichkeit bei der Messung. Mit der schnellen Aufnahmerate von 6 Pixeln pro Sekunde dauert die Erstellung eines MS-Bildes mit 62 500 Pixeln (250 x 250) weniger als drei Stunden. Bei der Ionisation durch die MALDI-Technologie werden die Moleküle in der Probe durch Laserbeschuss verdampft, ionisiert und anschließend massenspektrometrisch untersucht.

Die Flexibilität des neuen Systems lässt auch zu, die MALDI-Quelle gegen eine ESI (Electrospray Ionisation)-Quelle zu tauschen; auch flüssige Proben können mit dem Massenspektrometer analysiert werden.

Bildgebende Massenspektrometrie – Vielseitige Anwendungen

Mögliche Einsatzgebiete für das IM Scope Trio sind vielseitig – etwa die Analyse von Biomarkern, Wirkstoffen und deren Metaboliten in Geweben, Verteilung von Inhaltsstoffen in Nahrungsmitteln und Pflanzen oder auch die Analyse von Mikrodefekten oder geringsten Kontaminationen in synthetischen Materialien. Generell steht die Forschung & Entwicklung im Fokus des Systems.

Ein Beispiel für den zusätzlichen Informationsgehalt, den der Vergleich des optischen Bildes mit dem MS-Bild bringt, liefert folgende Betrachtung: Untersucht wurde ein Schnitt durch die Leber einer Ratte, die mit Quercetin behandelt wurde, einem sekundären Inhaltsstoff in vielen Nutzpflanzen, der auch im menschlichen Körper gesundheitsfördernd wirkt. Zeigt das MS-Bild (s. Abb. 5 A, online) alleine eine scheinbar zufällige, gleichmäßige Verteilung des Quercetins über die gesamte Probe, so lässt sich nach der Überlagerung mit der Mikroskopaufnahme (s. Abb. 5 B, online) bereits erkennen, wie die Lokalisation des Moleküls mit den Strukturen innerhalb des untersuchten Lebergewebes korreliert. Vergrößert man das überlagerte Bild (s. Abb. 5 C, online) ist eindeutig, dass alle detektierten Quercetin-Moleküle ausschließlich zwischen den Zellen oder an den Zellwänden lokalisiert sind und nicht im Zellinneren.

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Stattdessen einen größeren Laserstrahldurchmesser einzusetzen, hätte in diesem Fall zum Verlust der räumlichen Informationen über die Lokalisierung des Quercetins im Zellverbund geführt und die präzise räumliche Zuordnung zum Intrazellularraum bzw. den Zellmembranen wäre nicht mehr möglich gewesen.

Auflösung individuell wählen

Abhängig vom Untersuchungsobjekt ist eine mittlere oder hohe Ortsauflösung notwendig. Reicht eine mittlere Auflösung aus, um die Lokalisierung innerhalb größerer Gewebestrukturen zu untersuchen, so erfordert die Lokalisierung auf zellularer Ebene eine möglichst hohe Auflösung. Diese Technik ist zum Beispiel hilfreich, um die Verteilung von Medikamenten in Mikrostrukturen oder auch die Akkumulation ihrer Metabolite zu untersuchen.

Für die Untersuchung verschiedener Lipide aus der Netzhaut (Retina) des Auges wurde daher eine hohe Auflösung von 10 µm gewählt. Das retinale Pigmentepithel, das die innere und äußere Retina voneinander trennt, zeigt sich als dunkles Band auf der mikroskopischen Aufnahme (s. Abb. 3). MS-Bilder (s. Abb. 3) von zwei verschiedenen Lipiden (m/z = 798,54 und m/z = 872,61) wurden in mehreren Auflösungen aufgenommen (10 µm, 20 µm, 50 µm und 100 µm). Lediglich eine Auflösung von mindestens 10 µm lässt den Umriss des retinalen Pigmentepithels erkennen, der bei geringeren Auflösungen verloren geht.

Auswertung der Daten

Die spezielle „Imaging MS solution“ Software wird für die Datenaufnahme sowie für die -analyse verwendet und ermöglicht, mehrere MS-Bilder (s. Abb. 4) übereinander zu legen. Die hohe Auflösung der MS-Bilder erlaubt, die drei untersuchten Lipide exakt zuzuordnen. Während PC (Phosphatidylcholin,16:0/22:6) ausschließlich in der äußeren Retina vorkommen, kann man PC (18:0/22:6) direkt anschließend an das retinale Pigmentepithel in der inneren Retina und PC (16:0/18:1) noch weiter im inneren Bereich der Retina finden.

Hierachical Cluster Analysis (HCA), Region of Interest Analysis (ROI) und Principal Component Analysis (PCA) sind zusätzliche Tools zur statistischen Datenanalyse.

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Matrixbeschichtung möglich

Die außerordentliche Leistung des Massenspektrometers und die Probenvorbereitung sind essenziell, um MS-Bilder mit maximaler räumlicher Auflösung zu erhalten. Die für die Ionisierung notwendige Matrix wird konventionell in Flüssigkeit gelöst und auf die Probe gesprüht oder gespottet. Dabei kann es stets passieren, dass sich Zielanalyten in dieser Flüssigkeit lösen und innerhalb der Probe diffundieren. Dies führt dazu, dass trotz Geräten mit hoher Ortsauflösung die Probe eine so hohe Auflösung gar nicht mehr hergibt.

Shimadzu bietet daher mit dem IM Layer ein Gerät zur Matrixbeschichtung an, die diesen Effekt ausschließt. Die Matrix wird hierbei durch ein Sublimationsverfahren aufgebracht, die eine dünne Schicht sehr kleiner Matrixkristalle aufträgt und eine Delokalisierung der Analyten vermeidet.

Kombiniert mit dem IM Layer bietet das IM-Scope-System eine Komplettlösung für die Probenvorbereitung, die Aufnahme optischer und MS-Bilder mit höchster Ortsauflösung und deren Überlagerung sowie der (statistischen) Auswertung der ermittelten Daten mittels „Imaging MS solution“ Software.

* Dr. K. Bollig: Shimadzu Deutschland, 47269 Duisburg

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