Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie Die Kommunikation in lebenden Organismen mit der Scanning-Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie erforschen

Mit einer neuen mikroskopischen Methode ist es zum ersten Mal möglich, die Bindung zwischen zwei Proteinen im lebenden Zebrafisch quantitativ zu messen. Damit eröffnen sich völlig neue Perspektiven, Zellkommunikation in lebenden Organismen zu untersuchen, wie z.B. bei der Entwicklung von Wirbeltierembryonen.

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Das gesamte Leben basiert auf der Wechselwirkung zwischen Biomolekülen. Bislang war es schwierig, diese Kommunikation der Moleküle zu erforschen, da Messungen in vitro – außerhalb eines Lebewesens – die Komplexität im lebenden Organismus nicht widerspiegeln können und dadurch häufig inkonsistente Ergebnisse liefern. Beobachtungen im lebenden Organismus in vivo ergaben hingegen meist nur qualitative Informationen.

Ein Beispiel für das Zusammenspiel von Biomolekülen ist die Bindung zwischen Ligand und Rezeptor. Diese Bindung aktiviert die Kommunikation zwischen einzelnen Zellen und ist relevant für alle Prozesse, bei denen Zellen miteinander reden müssen. Am Biotechnologiezentrum Biotec der TU Dresden interessierte man sich besonders für die Wechselwirkung des Wachstumsfaktors Fgf8 mit seinen Rezeptoren Fgfr1 und Fgfr4. Der Wachstumsfaktor Fgf8 dient in der Embryonalentwicklung von Wirbeltieren dazu, den Zellen zu zeigen, wo im Embryo sie sich befinden und welche Organe sie bilden müssen (s. Hintergrundkasten). Welcher der beiden Rezeptoren der wichtigere ist, ist eine offene Frage. So ist in vitro die Wechselwirkung von Fgf8 mit Fgfr4 20-fach stärker als mit Fgfr1. Indirekte in-vivo-Experimente legen jedoch nahe, dass Fgfr1 der Hauptrezeptor für Fgf8 ist. Nur eine direkte Messung im lebenden Organismus kann diesen Wiederspruch auflösen.

Wie erfolgt die Messung der Bindung zweier Moleküle?

Eine häufig eingesetzte Methode, um Biomoleküle in vitro zu untersuchen, ist die Fluoreszenz-Korrelations-Spektros-kopie (FCS, s. Methodenkasten). Hier wird das Signal analysiert, welches farblich markierte Moleküle aussenden, wenn sie sich durch einen Beobachtungsbereich von einem Tausendstel der Größe eines Sandkorns bewegen. Diese Methode funktioniert an Zelloberflächen lebender Organismen aber nur sehr eingeschränkt, da die Zellen ständig ihre Form und Position ändern und damit die Zellmembran nicht stabil in dem winzigen Beobachtungsbereich verweilt. Des Weiteren ist es schwierig, die genaue Größe des Beobachtungsbereichs zu bestimmen, welche für quantitative Messungen bekannt sein muss.

Die Lösung: den Beobachtungsbereich ständig verschieben

Wie kann die praktische Methode der Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie auf dynamischen Zelloberflächen lebender Organismen angewendet werden? Die Lösung ist, den Beobachtungsbereich nicht nur an einem Ort zu parken sondern ständig senkrecht durch die Zellmembran durchzubewegen. Dadurch wird die Membran nie „aus den Augen“ verloren, auch wenn sich ihre Position ändert. Dieser Ansatz wird Scanning-FCS genannt. Durch einen Trick lässt sich auch die lästige Kalibrierung des Beobachtungsbereichs umgehen. Es werden einfach zwei Beobachtungsbereiche in einem kleinen, aber wohl bekannten Abstand benutzt. Bei dieser „Zwei-Fokus-FCS“ lässt sich aus dem Signal direkt die Konzentration und Beweglichkeit der Moleküle ablesen, auch wenn sich die Größe des Beobachtungsbereichs durch optische Verzerrungen im Lebewesen verändern sollte.

Markierung der Bindungspartner und in-vivo-Messung

Um die Bindung zweier Moleküle zu messen, werden die Bindungspartner mit unterschiedlichen Farbstoffen markiert (s. Abb. 1) – im vorliegenden Fall der Ligand Fgf8 mit dem grün fluoreszierenden Protein (GFP) und die Rezeptoren mit dem rot fluoreszierenden Protein (RFP). Das ausgesandte Licht wird mit zwei unterschiedlichen Detektoren gemessen. Aufgrund der unterschiedlichen Farben erkennt jeder Detektor nur eine Molekülart. Wenn beide Moleküle aneinander binden, ist das Signal in beiden Detektoren ähnlich. Aus dieser Ähnlichkeit lässt sich der Anteil der aneinander bindenden Moleküle bestimmen. Diese Methode bezeichnet man als Zwei-Farben-FCS.

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