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Ultraschnelle Echtzeit-PCR Die Sechs-Minuten-PCR

Autor / Redakteur: Dr. Michael Baßler, Dr. Christian Freese, Rainer Gransee, Antonia Winkler* / Dr. Ilka Ottleben

„Keep it fast and simple“ ist bei der molekularbiologischen Vor-Ort-Testung die Devise. Die Notwendigkeit einfacher, flexibler, kostengünstiger und schneller Testsysteme zeigt auch die aktuelle Corona-Pandemie. Bisher verfügbare Tests geraten hier oft an ihre Grenzen. Ein Mikrofluidik-Modul für eine ultraschnelle Echtzeit-PCR bietet nun Abhilfe.

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Abb. 1: Vollständig autonom arbeitendes Moving-Plug-Echtzeit-PCR-Modul
Abb. 1: Vollständig autonom arbeitendes Moving-Plug-Echtzeit-PCR-Modul
(Bild: Institut fur Mikrotechnik Mainz GmbH; ©Galaxy_love_design - stock.adobe.com)

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) hat sich seit ihrer Einführung in den 1980er-Jahren zum Goldstandard des molekularbiologischen Testens entwickelt und ist die Grundlage heutiger Vor-Ort-Testsysteme zum Nachweis von Infektionskrankheiten. Die am Markt befindlichen Vor-Ort-PCR-Tests sind allerdings im Wesentlichen proprietäre Lösungen einzelner Anbieter, die entweder zu teuer oder zu langsam sind, um Massentestung vor Ort zu ermöglichen. Ein zentraler Baustein zur Überwindung dieser Einschränkungen ist das in diesem Beitrag beschriebene Konzept der ultraschnellen Echtzeit-PCR. Ganz nach dem Motto „keep it fast and simple“ lässt sich auf dieser Basis ein flexibles und reaktionsschnelles Testkonzept aufbauen, das mit einfachen Verbrauchsmitteln und simpler Gerätetechnik auskommt. So können im Pandemiefall viele Hersteller weltweit und gleichzeitig alles Erforderliche für Massentestungen bereitstellen.

Die Corona-Pandemie verdeutlicht, dass weder die vorhandene Laborinfrastruktur noch die am Markt verfügbaren Vor-Ort-Testsysteme, so genannte Point-of-Care Test (POCTs) Systeme, eine Echtzeit-Kontrolle von Infektionswegen sowie eine schnelle, flexible und flächendeckende Pandemieüberwachung gewährleisten. Derzeit finden Tests fast ausschließlich in zentralen Laboren statt, sodass alleine der ­Versand der Proben stundenlange Verzögerungen verursacht. Die eigentliche Analysedauer ist in diesen Fällen gar nicht bestimmend für die Wartezeit bis zur Übermittlung des Ergebnisses. Ein wesentliches Hemm­nis für den flächendeckenden Einsatz von schnellen POCTs hingegen ist das vorherrschende Geschäftsmodell der Anbieter, das auf proprietären Geräten und patentierten Verbrauchsmitteln basiert, sodass derzeitige POCTs immer noch zu teuer angeboten werden, um breiten Einsatz zu finden. Zudem zeigt die jetzige Krise, dass die Anbieter über nicht ausreichende Produktionskapazitäten verfügen, um die erforderlichen Testkapazitäten bereitstellen zu können.

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Das öffentliche Leben wird jedoch auf unbestimmte Zeit nur mit massiven Ausweitungen der Tests z.B. in Schulen, Kindertagesstätten und Betrieben aufrechterhalten werden können. Um insbesondere im Fall erkannter Infektionsherde Ausbreitungswege unmittelbar verfolgen zu können und nicht weitgehend auf vorbeugende Quarantäne angewiesen zu sein, bedarf es POCTs, die ohne Zeitverzögerung valide Ergebnisse liefern. So können wirtschaftliche, gesellschaftliche und persönliche Lasten, die mit den Quarantänemaßnahmen einhergehen, weitgehend vermieden werden. Gelingt es gleichzeitig die Kosten pro Test maßgeblich zu reduzieren, wird es auch wirtschaftlich möglich, Verdachtsfälle mehrfach zu testen und vor allem Personal mit intensivem Kontakt zu besonders gefährdeten Personengruppen, z.B. in Einrichtungen der Altenpflege, regelmäßig vorbeugend zu untersuchen.

Der Nachweis von COVID-19 hat gezeigt, dass PCR-basierte Diagnostik sehr schnell und spezifisch an den jeweiligen Erreger angepasst werden kann und gleichzeitig eine hohe Sensitivität und Spezifität aufweist. Für eine PCR-Messung wird die Probe wiederholt Temperatur­zyklen ausgesetzt und es kann in jedem Zyklus über eine Fluoreszenzmessung überprüft werden, ob sich der gesuchte Erreger in der Probe befindet. Die Anzahl der Zyklen, nach der das Fluoreszenzsignal ansteigt, liefert auch gleichzeitig eine Aussage über die ursprünglich in der Probe vorhandene Anzahl von Viren. Die am Fraunhofer IMM entwickelte Oszillations-Durchflussmethode ermöglicht eine solche quantitative PCR (qPCR) mit extrem kurzer Analysezeit von derzeit sechs Minuten.

Grenzen bisheriger PCR-Systeme

Aktuell auf dem Markt erhältliche, quantitative Point-of-Care-PCR-Systeme haben bislang einige Einschränkungen, die sich neben den Kosten und der teilweise eingeschränkten Möglichkeit, eine Probe auf mehrere Erreger gleichzeitig zu analysieren, vor allem in der Testdauer manifestiert (der so genannten turn-around-time). Diese liegt im besten Fall bei 30 Minuten. Dies ist die Zeit, die benötigt wird, um eine genommene Probe zu analysieren und das Ergebnis anzuzeigen. Sie ergibt sich aus dem kurzen, manuellen Einbringen der Probe in das POCT-Kartuschen-System, der automatisierten Probenvorbereitung durch das System (also der Bereitstellung der in den Erregern vorhandenen Nukleinsäuren) und der nicht unerheblichen Zeit für die Durchführung der eigentlichen PCR mit den dazu benötigten zyklischen Temperaturwechseln.

IMM qPCR-System

Die so genannte oszillatorische PCR gewährt den Vorteil der sehr schnellen Nukleinsäure-Amplifikation, da im Gegensatz zu konventionellen Systemen hier keine aufwändigen Aufheiz- und Abkühl-Zyklen periodisch durchlaufen werden müssen. Hier wird das Probenvolumen wiederholt vorwärts und rückwärts durch die vorgeheizten Temperaturzonen bewegt. Die Anzahl der Pumpzyklen und die Temperaturen der Heizzonen können flexibel an die Anforderungen der jeweili- gen PCR-Reagenzien angepasst wer- den.

Ein bereits früher am Fraunhofer-Institut für Mikrotechnik und Mikrosysteme IMM entwickeltes, ultraschnelles Mikrofluidikmodul, welches 30 PCR-Zyklen in sechs Minuten ermöglicht und auf dem Konzept eines zwischen zwei Temperaturzonen oszillierenden Flüssigkeitstropfens basiert, ermöglicht die Amplifikation nativer genomischer Desoxyribonukleinsäure-Moleküle (DNA). Das nun weiterentwickelte System erzeugt qPCR-Amplifikationsplots hoher Qualität und zusätzlich eine sensitive Schmelzpunktanalyse, die mit Daten aus kommerziellen Echtzeit-Cyclern vergleichbar ist. Diese Funktionen liefern dem Benutzer alle Informationen, die für die Analyse von PCR-Produkten erforderlich sind. Das System verwendet Leuchtdioden (LED) zur Beleuchtung und eine preiswerte CCD-Kamera zur optischen Detektion. Unter Nutzung von Bilddatenverarbeitung wird die Kamera gleichzeitig für die automatisierte Prozesskontrolle eingesetzt. Das System ermöglicht die Durchführung von schnellen und robusten Nukleinsäure-Amplifikationen mit integrierter Echtzeit-Messtechnik. So erfolgen gleichzeitig die Amplifikation und die Quantifizierung der Infektionserreger.

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