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UV-Vis- und Fluoreszenzspektroskopie DNA-Quantifizierungen sicher und effizient durchführen

Autor / Redakteur: Andrew Page* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

In der Regel wird für die DNA-Quantifizierung entweder UV-Vis- oder Fluoreszenzspektroskopie eingesetzt. Da beide Methoden Vor- und Nachteile besitzen, ist es wichtig, die Methode im Kontext der gesamten Analyse inklusive Up- und Downstream-Prozesse zu betrachten.

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(Bild: Thermo Fisher Scientific)

Für Molekularbiologen ist die DNA-Quantifizierung ein wichtige Routine-Technik. Dabei sind die erhaltenen Messdaten selbst nicht die endgültigen Ergebnisse einer Analyse, sondern werden häufig für weiterführenden Messungen benötigt.

Da es sich bei den Proben um biologische Systeme handelt, die einer gewissen Variation unterliegen, ist die DNA-Quantifizierung ein wichtiger präanalytischer Schritt, der für die folgenden Analysenschritte von hoher Bedeutung ist. Die beiden am häufigsten eingesetzten Methoden sind die UV-Vis- und die Fluoreszenz-Spektroskopie. Bei gereinigter DNA ist die Verwendung eines UV-Vis-Spektralphotometers üblich, das die Extinktion der Probe bei 260 nm (A260) misst. Vorteile dieser Technik sind die schnelle und einfache Durchführung, also eine hohe Anwenderfreundlichkeit.

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Fluoreszenz-Techniken erfordern im Vorfeld der Analyse eine spezielle Behandlung der Proben mit fluoreszierenden Substanzen, wie Hoechst oder Pico-Green-Farbstoffe, die an die DNA gebunden werden müssen. Dies macht zusätzliche Arbeitsschritte erforderlich, bietet aber dafür den Vorteil höherer Genauigkeit und größerer Sensibilität gegenüber niedrigen Konzentrationen.

Die Entscheidung darüber, welche dieser Techniken verwendet wird, sollte der Anwender im Kontext der Gesamtanalyse betrachten.

DNA-Quantifizierung – In welchem Bereich liegen die Konzentrationen?

Der wichtigste Unterschied zwischen UV-Vis- und Fluoreszenz-Spektroskopie ist der nutzbare Konzentrationsbereich: Traditionelle, küvettenbasierte Spektralphotometer sind in der Regel für die Messung zwischen etwa 0,4 und 75 ng/µl geeignet, während variable Weglängen-Instrumente wie das Thermo Scientific Nanodrop 2000 Spektralphotometer nicht auf die Benutzung von UV-Vis-Küvetten beschränkt sind und daher auch für die Messung von Konzentrationen bis zu 15 000 ng/µl geeignet sind. Dies deckt eine Vielzahl der Standard-Applikationen ab.

In einigen medizinischen Fragestellungen, wie z.B. Tumor-Biopsien sind die Konzentrationen allerdings zu niedrig oder die Proben nicht ausreichend rein, um mit UV-Vis quantifiziert zu werden. In solchen Fällen sollte die Fluoreszenz-Spektroskopie verwendet werden: Das Thermo Scientific Nanodrop 3300 Fluoreszenz-Spektrometer kann DNA-Proben zwischen 0,05 und 2000 pg/µl quantifizieren.

Vielleicht die wichtigste Überlegung bei der Auswahl des geeigneten Spektrometers ist aber der nutzbare dynamische Bereich des Instruments. Instrumente mit einer festen Spaltbreite erfordern mehrere Messungen mit unterschiedlichen Küvetten oder Zubehör bzw. die Analyse von mehreren Verdünnungen pro Probe. Dies kostet Zeit und der Anwender benötigt für die Messung mehr – oftmals wertvolle – Probensubstanz.

Kontaminationen müssen bei der DNA-Quantifizierung beachtet werden

Während die Verwendung eines Fluoreszenzspektrometers die Detektion von Verunreinigungen ausschließt, kann bei einem Spektralphotometer eine Bewertung der Reinheit einer DNA-Probe durch Vergleich der Absorption bei 260 nm zu der bei 280 und 230 nm vorgenommen werden. Der Vergleich der A260/A280- und A260/A230-Verhältnisse ist ein etabliertes Verfahren zur Bestimmung der Proben-Reinheit. Hiermit können frühzeitig Protein-Kontaminationen, der Hinweis auf potenzielle Kohlenhydrat-Verunreinigungen oder die Verschleppung von Chemikalien aus der Extraktion erkannt werden. Zusätzlich dazu kann die Analyse der Spektren-Form – insbesondere die Wellenlänge der Peaks und der Wellentäler – weitere Informationen über Kontaminationen liefern (s. Abb. 2). Einige Schadstoffe zeigen dabei charakteristische Spektren, beispielsweise Phenol, das eine starke Absorption bei 270 nm zeigt. So sind Phenol-Verunreinigungen z.B. an einer Verschiebung des Peaks, der normalerweise bei 260 nm liegt, zu einer höheren Wellenlänge (nähert sich 270 nm) zu erkennen.

Spezifität der Methoden zur DNA-Quantifizierung vergleichen

Alle Nukleotide absorbieren Licht bei 260 nm, daher sind Spektralphotometer in der Regel nicht in der Lage, zwischen dsDNA, ssDNA, RNA und ungebundenen Nukleotiden zu unterscheiden. Um die aus einer Probe extrahierte DNA genau zu quantifizieren, darf die DNA entweder keine anderen Nukleinsäuren enthalten oder es muss ein Fluoreszenzspektrometer verwendet werden. Viele kommerziell erhältliche DNA-Extraktions-Kits sind hochselektiv für DNA, sie entfernen RNA mit RNAse-Enzymen und über entsprechende Waschschritte auch ungebundene Nukleotide. Einige DNA-Extraktionsverfahren, insbesondere viele selbstentwickelte Verfahren, extrahieren DNA nicht spezifisch, sodass ein Gemisch aus DNA und RNA übrig bleibt, das nur mit Fluoreszenzspektrometern und spezifischen fluoreszierenden Substanzen genau quantifiziert werden kann.

Analysegeschwindigkeiten richtig beurteilen

Die Geschwindigkeit, mit der DNA quantifiziert werden kann, variiert je nach der verwendeten Technik drastisch. Viele Gerätehersteller geben bei der Analysezeit nur die reine Messzeit an. Dies ist aber irreführend. Um die Methodendauer richtig beurteilen zu können, muss hingegeder gesamte Analyseprozess betrachtet werden. Zu diesem Prozess gehören beispielsweise:

  • eine notwendige Instrumentenaufwärmphase oder die Software-Parametrisierung
  • Probenbeladung
  • Probenverdünnung
  • Messzeit
  • Probenentnahme
  • Gerätereinigung
  • der Daten-Export
  • Konzentrations-Berechnungen

Klassische Spektralphotometer benötigen häufig Aufwärmzeiten und erfordern den zeitraubenden Einsatz von Küvetten, Verdünnungen der Probe oder auch eine manuelle Konzentrationsberechnung. Obwohl die Aufwärmphase bei modernen Systemen nicht mehr so lange dauert, kann mit küvettenlosen Systemen wie dem Nanodrop eine deutliche Zeitersparnis erzielt werden.

Ein wesentlicher Vorteil der UV-Vis-Spektroskopie gegenüber der Fluoreszenz-Spektroskopie ist die direkte Messung der Probe, während bei der Fluoreszenz-Spektroskopie Reagenzien hergestellt und mit den Proben vor der Messung gemischt werden müssen. Dies macht die Messung zeitaufwändiger und durch die zusätzlichen Arbeitsschritte auch fehleranfälliger.

Kurven eines Standards aufnehmen

Insbesondere durch die Varianz bei der Qualität der Fluroeszenzchemikalien sowie beim Ansetzen der Proben (Inkubationszeit, Temperatur etc.) kann es hier zu abweichenden Messergebnissen kommen. Diese Unterschiede können durch die Aufnahme eines Standards ermittelt werden. Allerdings muss hier in der Regel auch eine Verdünnungsreihe hergestellt werden, die wiederum Zeit in Anspruch nimmt und eine potenzielle Fehlerquelle darstellt.

Welche Methode zur DNA-Quantifizierung ist die richtige?

Es gibt mittlerweile einige Fragestellungen, in denen die Vorteile von UV-Vis- und Fluoreszenz-Spektroskopie benötigt werden. So erfordern zum Beispiel einige der Next-Generation-Sequenzierungs-Protokolle Messungen mit beiden Techniken, um sowohl die DNA spezifisch zu quantifizieren als auch das Vorhandensein von Hemmstoffen zu beurteilen.

Für die meisten Anwendungen ist aber durchaus die Quantifizierung unter Verwendung einer der genannten Techniken ausreichend. Für relativ reine Proben ist UV-Vis-Spektroskopie die Methode der Wahl, da sie in Bezug auf Benutzerfreundlichkeit und Geschwindigkeit deutliche Vorteile zeigt. Bei niedrigen Konzentrationen oder der Anwesenheit von RNA spielt die Fluoreszenz-Spektroskopie ihre Stärken aus und der Anwender sollte die zusätzliche Zeit in Kauf nehmen. n

* A. Page: Thermo Fisher Scientific, Wilmington/USA

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