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Automatisierte Analytik für die Doping-Kontrolle Doping mit Nikotin?

Autor / Redakteur: Guido Deußing* / Dr. Ilka Ottleben

Das Zentrum für präventive Dopingforschung der Sporthochschule Köln rüstet auf im Kampf gegen Dopingsünder. Für die Bestimmung verdächtiger Substanzen setzt das Institut auf ein vollautomatisiertes hochempfindliches Dried-Blood-Spot-LC-MS/MS-Analysensystem. Damit lassen sich auch Nikotin und seine Metaboliten automatisiert in Blut bestimmen. Die Substanz ist in den letzten Jahren ins Blickfeld der Doping-Kontrollbehörden geraten.

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Bei Sportarten, in denen es auf Reaktionsschnelligkeit und Konzentration ankommt, könnte der Konsum von Nikotin den Sportlern Vorteile verschaffen.
Bei Sportarten, in denen es auf Reaktionsschnelligkeit und Konzentration ankommt, könnte der Konsum von Nikotin den Sportlern Vorteile verschaffen.
(Bild: gemeinfrei)

Wenn es um sportliche Höchstleistungen geht, das persönliche Leistungsvermögen ungeachtet hinreichender Trainingseinheiten jedoch unzureichend ist, sucht mancher Athlet sein Heil in der Einnahme leistungssteigernder Präparate. Mit welcher Systematik hierbei vorgegangen wird, zeigt der ARD-Dokumentarfilm „Geheimsache Doping – Wie Russland seine Sieger macht“. Ein Fernsehteam des WDR liefert darin Beweise für flächendeckendes Doping in der russischen Leichtathletik und ein von Trainern und Verbandsfunktionären getragenes korruptes Betrugssystem [1].

Nicht jedes Mittel aber, das die physische und oder mentale Leistungsfähigkeit positiv beeinflusst, gilt als illegal, als Dopingmittel. Dennoch hat die Welt-Anti-Doping-Agentur (WADA) manche Substanz wegen ihrer besonderen physiologischen Wirkung unter Verdacht, im sportlichen Wettkampf zur Leistungssteigerung missbraucht zu werden. Die WADA prüft, ob eine Ächtung und ein Verbot verdächtigter Substanzen auszusprechen sei. Auf der Beobachtungsliste der WADA befanden sich in 2015 u.a. Medikamentenwirk­stoffe wie Bupropion, Phenylephrin, Phenylpropanolamin, Pipradol, Synephrin sowie Stimulanzien wie Koffein und Nikotin, sprich die anregenden Bestandteile von Genussmitteln wie Kaffee und Tee sowie Tabakerzeugnissen.

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Doping mit Nikotin? Mehr als ein Verdacht

Im Jahr 2011 berichtete die Süddeutsche Zeitung (SZ), Wissenschaftler an der Universität Lausanne (Schweiz) hätten bei Sportlern unterschiedlicher Disziplinen erhöhte Nikotinwerte im Urin festgestellt [3]. „Es (Nikotin) verbessert nicht die Ausdauer oder Muskelkraft, versetzt aber das Gehirn in einen anderen Zustand“, zitierte die SZ damals den habilitierten Pharmakologen Fritz Sörgel, Leiter des Instituts für Biomedizinische und Pharmazeutische Forschung (IBMP) der Universität Nürnberg und anerkannter Dopingexperte [4]. Bei Sportarten, in denen es auf Reaktionsschnelligkeit und Konzentration ankommt, könne der Konsum von Nikotin den Sportlern Vorteile verschaffen.

Während das Rauchen von Tabakerzeugnissen mit erheblichen gesundheitlichen Risiken verbunden ist, erweisen sich E-Zigaretten, Kau- oder Schnupftabak als durchaus attraktive, weil offenkundig mit weniger negativen Begleiterscheinungen behaftete Alternativen. Gleiches gelte für so genannte Snus, eine in Norwegen und Schweden verbreitete Form oral konsumierten Tabaks. „Snus stehen im Verdacht, zu Dopingzwecken missbraucht zu werden“, berichtet Professor Mario Thevis vom Zentrum für präventive Dopingforschung der Sporthochschule Köln.

In Ermangelung klinischer Studien und fundierter Erkenntnisse über die Einnahme nikotinhaltiger Produkte zur Steigerung der Leistungsfähigkeit sowie generell aufgrund der Tatsache, dass die WADA Nikotin auf die Beobachtungsliste potenziell verdächtiger Dopingsubstanzen gesetzt hat, machte sich Thevis mit Kölner Kollegen sowie einem Wissenschaftler des National Veterinary Institute des Department of Chemistry im schwedischen Uppsala daran, eine „schnelle und kostengünstige“ Analysenmethode zu entwickeln, mit der sich Nikotin und seine Metaboliten nachweisen und Rückschlüsse auf die Art der Nikotinaufnahme ziehen lassen [5]. Bei der Wahl des Analyseverfahrens rückte die Dried-Blood-Spot-Analyse (DBS) in Verbindung mit einer online-geschalteten Festphasenextraktion (SPE) und anschließenden LC-MS/MS-Bestimmung der Analyten in das Blickfeld von Thevis et al. [6].

Doping-Kontrolle – Kosten und Geschwindigkeit entscheidend

Die DBS hat sich laut der Wissenschaftler bereits vielfach bewährt u. a. in der vorklinischen Pharmaforschung, im Monitoring therapeutisch verwendeter Wirkstoffe, der forensischen Toxikologie sowie zur Untersuchung von Stoffwechselerkrankungen. Ebenso gäbe es inzwischen einige Beispiele für den Einsatz der DBS innerhalb der Dopinganalytik.

Laut Mario Thevis et al. biete die DBS eine Vielzahl von Nutzwerten gegenüber herkömmlichen Strategien der Entnahme von Blutproben: Die DBS sei mehr oder minder minimalinvasiv – ein Piek in die Fingerbeere genügt, um eine für die Analyse hinreichende Menge Blut (etwa 20 µL) zu entnehmen; wenige Tropfen Blut, aufgesogen von einem geeigneten zellulosehaltigen, filterpapierartigen Trägermaterial, genügten für eine erfolgreiche Dopingkontrolle für ausgewählte Substanzen. Hinzu komme eine hohe Langzeitstabilität der Blutproben bei Raumtemperatur, wird im Zuge des rasch verlaufenden Trocknungsprozess die Feuchtigkeit entfernt und die Enzymaktivität inaktiviert, schreiben die Wissenschaftler im Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis [5].

Um die Analyse durchführen zu können, sind zahlreiche Schritte der Probenvorbereitung erforderlich. „Zurzeit gehören zum voranalytischen Arbeitsablauf in der Regel das Herauslösen bzw. Ausstanzen des getrockneten Bluts, die Extraktion mittels geeigneter Lösemittel, gelegentlich verbunden mit einer Ultraschallbehandlung, weitere Reinigungsschritte, das Ausfällen und Entfernen enthaltener Proteine, Filtration und die Überführung des resultierenden Extrakts in ein geeignetes Probenvial für die sich anschließende LC-MS/MS-Bestimmung“, schreiben Thevis et al. Um den vor allen Dingen großen manuellen Arbeitsaufwand zu minimieren und die DBS-Probenahme für einen hohen Probendurchsatz in der Routineanalytik zu qualifizieren, bedarf es der Automatisierung.

Automatisierung kommerziell verfügbar

Thevis et al. verwendeten daher für die Bestimmung von Nikotin, dessen Hauptmetaboliten Nornikotin, Kotinin und trans-3’-Hydroxykotinin (trans-3’-HCOT) sowie der Alkaloide Anabasin und Anatabin ein unter Einsatz des Multi-Purpose-Samplers (Gerstel-MPS) vollständig automatisiertes DBS-System (Gerstel-DBS-A), gekoppelt an eine Online-SPE (Gerstel-SPE-XOS) und angebunden an ein UHPLC-HR-MS/MS (Thermo Dionex Ultimate 3000 / Q Exactive Plus, Thermo Scientific). Thevis et al.: „Unter Einsatz einer Online-SPE kann der DBS direkt extrahiert, gereinigt und analysiert werden.“ Die Automatisierung der DBS-Probenvorbereitung reduziere nicht allein den Arbeitsaufwand, betonen die Wissenschaftler, sondern verbessere obendrein die Extraktionsleistung (Durchflussdesorption der Analyten [6]) sowie die Empfindlichkeit der Messung, während sich das Kontaminationsrisiko reduziere.

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Entwickelt wurde die Online-DBS-SPE-LC-MS/MS-Methode unter Verwendung von Standardlösungen unterschiedlicher Konzentrationen, mit denen Blutproben von freiwilligen Spendern, die weder geraucht noch Snus konsumierten hätten, dotiert wurden; die Validierung erfolgte gemäß den Empfehlungen der WADA und des European Bioanalysis Forum (EBF). Zur Quantifizierung der Zielanalyten wurden deuterierte Analoga eingesetzt. Um potenzielle Unterschiede in der Pharmakokinetik untersuchen zu können, wendeten Thevis et al. ihre Methode auf authentische Proben an, das heißt auf Blutproben, die nach Genehmigung durch die örtliche Ethikkommission und schriftlicher Zustimmung der Probanden einer Reihe von Zigaretten- und E-Zigarettenrauchern sowie Snus-Konsumenten entnommen wurden.

Unterscheidung zwischen Genusskonsum und Doping

Bei der Entwicklung habe man einen besonderen Wert darauf gelegt, die Methode insbesondere im „Hinblick auf Reproduzierbarkeit und Beschleunigung des Arbeitsablaufes“ zu optimieren, schreiben Thevis et al. [5]. Stellschrauben bilden hierbei vor allem die Desorption der DBS, die Aufreinigung mittels SPE, der Lösemittelgradient sowie die massenspektrometrische Detektion. Es sei ihnen gelungen, berichten die Wissenschaftler, mittels der automatisierten DBS-Analyse alle Zielanalyten präzise, spezifisch und akkurat zu bestimmen. Die Bestimmungsgrenze lag für alle genannten Verbindungen bei 5 ng/mL. Aufgrund der erfolgreichen Analyse realer Blutproben von Rauchern, E-Zigaretten- und Snus-Konsumenten sei die Anwendbarkeit ihrer Methode auf Routine-Dopingkontrollen möglich. „Die Zielverbindungen wurden allesamt in den Realproben gefunden“, schreiben Thevis et al.

Überdies habe die statistische Evaluierung einen signifikanten Unterschied zwischen der Nikotinaufnahme über die Lunge (inhalativ) und die Mundschleimhaut (bukkal) ergeben und zwar anhand des Verhältnisses von Nikotin und Nornikotin. Dies bedeute, schreiben Thevis et al., auf Grundlage pharmakokinetischer Eigenschaften sowie der Kenntnis des Nikotinstoffwechsels lassen sich Rückschlüsse auf das Konsumverhalten ziehen.

Literatur:

[1] www.daserste.de/information/reportage-dokumentation/dokus/videosextern/geheimsache-doping-wie-russland-seine-sieger-macht-102.html

[2] www.dbs-npc.de/leistungssport-downloads.html?file=tl_files/dateien/leistungssport/anti-doping/Verbotsliste-2015-deutsch.pdf

[3] www.sueddeutsche.de/sport/nikotin-missbrauch-im-sport-nachhilfe-mit-der-e-zigarette-1.1970094

[4] www.franken-wiki.de/index.php/Fritz_Sörgel

[5] Laura Tretzel, Andreas Thomas, Thomas Piper, Mikael Hedeland, Hans Geyer, Wilhelm Schänzer, Mario Thevis, Fully automated determination of nicotine and its major metabolitesin whole blood by means of a DBS online-SPE LC-HR-MS/MS approachfor sports drug testing, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 123 (2016) 132–140

[6] www.laborpraxis.vogel.de/bioanalytik-pharmaanalytik/articles/510434/

* G. Deußing: Redaktionsbüro Guido Deußing, 41464 Neuss

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