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Liquid Handling Dynamische und präzise Bewegung von Piko-, Nano- und Mikrolitern in Mikrokanälchen

Autor / Redakteur: Claus Fütterer* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Reproduzierbare Bewegung von Mikro-, Nano- und Picoliter sowie von kleinsten Objekten in Kapillaren oder Mikrofluidikkanälen werden durch den Übergang von liquid-volumen- zu pneumatisch-druckgesteuerten Verfahren ermöglicht. Eine neue Technologie schöpft die Möglichkeiten aus.

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Abb.1: Die hydrodynamische Restriktion führt zu einer starken Amplifikation der Strömungsgeschwindigkeit, im dargestellten Fall 100 000-fach. Somit führt die lineare Kolbenbewegung der Spritze zu einer Volumenänderung von 100 µl/mm, im Mikrokanal 1nl/mm.
Abb.1: Die hydrodynamische Restriktion führt zu einer starken Amplifikation der Strömungsgeschwindigkeit, im dargestellten Fall 100 000-fach. Somit führt die lineare Kolbenbewegung der Spritze zu einer Volumenänderung von 100 µl/mm, im Mikrokanal 1nl/mm.
(Bild: Biophysical Tools)

Anwendungen der Mikrofluidik nehmen rapide zu, da man langsam lernt, deren nicht geringe Schwierigkeiten zu beherrschen. Eines dieser Probleme ist die Strömungskontrolle. Zu den traditionellen Instrumenten in Biologie, Medizin und sonstigen Bereichen gehören Spritzen- und Peristaltikpumpen. Beide Pumpen nutzen Volumenverdrängung, um Fluide wie Flüssigkeiten oder Gase zu bewegen.

Probleme bei Spritzen- und Peristaltikpumpen

Bei der Spritzenpumpe führt eine präzise motorgetriebene Kolbenbewegung in einem Zylinder zu einer Strömung des verdrängten Fluidvolumens. Dieses Instrument kommt in mehreren Punkten der Laborarbeit entgegen: Oft liegen die Fluide schon in einer Spritze vor. Bei der Arbeit kann man die Kolbenbewegung unmittelbar beobachten und das transportierte Volumen durch Messung der Drehung des Antriebsmotors sehr genau bestimmen. Eine Miniaturisierung hingegen ist wegen der auf kleinen Skalen dominierenden Adhäsionskräfte schwerlich möglich und auch kaum von Interesse wegen der Begrenzung auf das dann sehr kleine Zylindervolumen und die ständig wiederkehrende Erfordernis einer Wiederbefüllung. Dennoch beobachtet man in Laboren noch häufig den Einsatz von oft bereits vorhandenen Spritzenpumpen für die Strömungskontrolle in Mikrokanälen. Meist ist diesen Versuchen jedoch kein Erfolg beschert.

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Warum ist das so? Hydrodynamisch betrachtet liegt eine dramatische Restriktion der Flüssigkeitssäule vor. Wenn z.B. eine Spritze mit einer Querschnittsfläche von A = 1 cm2 an einen typischen Mikrokanal von 10 x 100 µm = 0,00001 x A Querschnitt angeschlossen wird, resultiert daraus eine 100 000-fache Amplifikation der Strömungsgeschwindigkeit im Kanal. So bewirkt eine Bewegung des Kolbens um 1 µm/min eine Bewegung der Flüssigkeitssäule im Mikrokanal um 0,1 m/min. Eine derart kleine Geschwindigkeit ist bereits eine beachtliche Herausforderung für die Antriebstechnik. Benötigt man eine solch pulsationsarme Strömung, sind sehr teure Präzisionsspindeln und Motoren erforderlich. Jedoch erschweren nun die Elastizität der Spritze und der Schläuche, die Kompressibilität der Flüssigkeit und der darin enthaltenen Gaseinschlüsse die Arbeit, da diese zu einer starken Reaktionsverzögerung führen können. Zur Abschätzung der Verzögerung hat Biophysical Tools einen Web-Rechner bereitgestellt, welches deutlich macht, dass sich dieser Ansatz für Mikrosysteme nicht eignet (s. LP-Plus).

Beim Peristaltikverfahren wird hingegen die Volumenverdrängung durch periodische Schlauchquetschung erzielt. Beispielsweise kann hierfür ein Schlauch linear oder – eher typisch – rotativ gequetscht werden, wodurch eine Fluidbewegung in Rotationsrichtung erzielt wird. Eine genaue Bestimmung des Perfusionsvolumens ist jedoch nicht möglich, da es von den Eigenschaften des Schlauches (die z.B. von der Temperatur abhängen), des Drucks des Fluids und des Andrucks der Quetschrollen abhängt. Dieses Verfahren erlaubt dennoch die einfache Realisierung zirkulärer Strömungen. Dabei ist die Strömung stark pulsbehaftet, hervorgerufen durch die ungleichmäßige Volumenverdrängung während des Quetschungsprozesses. Auch hier übersteigen die Verdrängungsvolumina leider das zu kontrollierende Volumen im Mikrokanal um mehrere Größenordnungen. Dieser Ansatz lässt sich zwar miniaturisieren, jedoch widerspricht der Aufwand der Maxime des möglichst kostengünstigen, wegwerfbaren Mikrofluidik-Chips.

Elektroosmose als alternative Methode

Es gibt inzwischen neue Ansätze, mit denen man auch auf der Mikroskala kontrolliert Strömungen erzeugen kann. Ein sehr elegantes Verfahren ist die Elektroosmose. Ladungen an den Kanaloberflächen werden von Gegenladungen im Fluid kompensiert. Legt man einen elektrischen Gradienten in Kanalrichtung an, verschieben sich die beweglichen Gegenladungen relativ zur Wand und ziehen die gesamte Flüssigkeit mit. Der Vorteil dieses Ansatzes ist die sehr geringe Strömungsdispersion und extrem preiswerte Umsetzung. Jedoch ist eine sehr sorgfältige Präparation der Kanalwände erforderlich, und es verbietet sich natürlich das Arbeiten mit geladenen Objekten, wie z.B. Zellen, DNA oder den meisten Proteinen.

Weitere Verfahren beruhen auf akustischen Wellen (SAW, Piezo), magnetischen Mikropartikeln oder quellenden Polymeren. Hierbei können jedoch nur kleine Druckgradienten erzielt werden, oft muss man eine Erwärmung der Fluide in Kauf nehmen und die Präparation des Mikrofluidik-Chips ist meist aufwändig. Man riskiert außerdem die unspezifische Wechselwirkung mit den zu untersuchenden Zellen oder Molekülen.

Druckbasierte Verfahren lösen die Probleme

Gesucht wird jedoch ein universelles und robustes System. Die Lösung des Problems wird durch die Thermodynamik nahe gelegt: Die extensive Zustandsgröße Volumen skaliert mit der 3. Potenz der Systemgröße, die konjugierte intensive Kraft Druck jedoch bleibt konstant. Also kontrolliert man besser den Druck anstelle des Volumens, um eine Skalenunabhängigkeit zu erreichen. Somit können bequem makroskopische Drucksensoren und Ventile für beliebig kleine oder große Strömungsraten eingesetzt werden.

Mehr noch: Durch die rasche Zunahme des hydrodynamischen Widerstandes bei Herabskalierung eines Kanals (~1/Systemgröße) wird dieser Ansatz sogar noch vorteilhafter, da die erforderliche Präzision der Druckregulierung für extrem feine Strömungen abnimmt. Ein oft unterschätzter weiterer Vorteil ist, dass die Gefahr der Zerstörung eines sehr engen oder verstopften Mikrokanals durch die unkontrollierte Druckerhöhung durch die beschriebenen konventionellen Pumpensysteme hier gebannt ist.

Dies ausnutzend konnte man in älteren Aufbauten häufig hydrostatische Druckquellen finden: Ein erhöht aufgehängtes Reservoir, von welchem ein Schlauch zum Mikrofluidik-Chip herabgeführt wurde, kann durch eine motorisierte Schraube präzise auf und ab bewegt werden. Dieser Aufbau zeigt zwar eine ausgezeichnete Präzision und Stabilität, ist jedoch langsam und benötigt wie Spritzenpumpen einen teuren mechanischen Antrieb. Daneben ist er sehr anfällig für Erschütterungen und Umgebungsdruckschwankungen.

Pneumatische Steuerung des Drucks

Wie kann man nun die Nachteile der vorgestellten Ansätze vermeiden? Wäre eine pneumatische Druckgenerierung vorteilhaft? Eine solche Frage kann man mit Ja beantworten, denn Umgebungsdruckschwankungen werden so automatisch kompensiert, und eine strikte Trennung von Probe und Strömungskontrolle schließt Verunreinigungen völlig aus: Alle Flüssigkeiten können entweder in einem externen Behälter oder sogar auf den wegwerfbaren Mikrofluidikchip selbst verlegt werden.

Die einfachste Realisierung besteht aus einer Luftdruckquelle „von der Stange“ (Pumpe, Druckflasche, Druckleitung im Labor), einem Reservoir mit präzisem Drucksensor und zwei Digitalventilen. Der Druckbehälter wird über das erste Ventil solange befüllt, bis der Solldruck erreicht wird. Dieser Druck wird dann durch das zweite Digitalventil auf das Reservoir und den Mikrofluidikkanal angewendet. Dieser Ansatz ist sinnvoll, wenn man die Strömungsgeschwindigkeit nicht variieren möchte. Werden jedoch dynamischere Strömungen benötigt, oder soll die Strömung zuverlässig gestoppt werden, ist ein anderer Ansatz erforderlich. Hierzu wird der Druckbehälter über ein graduell geöffnetes Ventil gespeist. Schnelle oder langsame Druckerhöhungen sind nun möglich, eine Drucksenkung jedoch noch nicht. Hierfür wurde Anfang der 2000er-Jahre ein feststehendes Leckventil eingeführt (Fütterer et al. Lab-on-a-Chip 2004). Nun wird der Druckanstieg durch das regelbare Analogventil und der Druckabfall durch das feststehende Leckventil vorgegeben. Dieses System erlaubte es damals zum ersten Mal, mikrofluidische Strömungen robust und in wenigen Sekunden zuverlässig einzustellen, insbesondere zu stoppen, beispielsweise um Zellen oder Einzelmoleküle zwecks Beobachtung festzuhalten („fluidische Falle“). Dieser Ansatz hat jedoch zahlreiche Kinderkrankheiten: Es muss ein ständiger Gasverlust durch das Leckventil kompensiert werden. Daher sind relativ große Druckquellen, z.B. in Form von voluminösen Labor-Gasflaschen notwendig. Neben der mangelnden Regulierungsmöglichkeit des Druckabfalles kommen noch andere Probleme hinzu, wie etwa eine sub-optimale Regelung. Sind sowohl Druck als auch Vakuum zu regeln, ist die Umsetzung mit diesem Ansatz äußerst schwierig.

Neuer Ansatz ermöglicht extreme Strömungsdynamik

Diese Probleme konnten 2012 durch einen neuen Ansatz (Patent eingereicht) gelöst und in Form der P2CS-Serie (Precision Pressure Control System) von Biophysical Tools realisiert werden. Nun werden mehrere nichtlinear gekoppelte Ventile synchron betätigt. Das Leckventil entfällt, wodurch nun auch wertvolle Gase oder Gase mit Gefahrenpotenzial genutzt und sehr kompakte OEM/portable Versionen mit sehr kompakten Druckquellen realisiert werden können. Die Symmetrie des Aufbaus ergibt die Gleichheit von Anstiegszeit und Abfallszeit (bis zu 20 mbar/ms). Das neue Verfahren ermöglicht es, die Dynamik der Strömung bis zu den durch physikalische Gesetze vorgegebenen Grenzen auszureizen. Als „Nebenprodukt“ kann der gewünschte Regel-Druckbereich leicht durch Anschluss einer Vakuumquelle auf negative Werte ausgedehnt werden. Der Wertebereich der Strömungsrate kann optional auf sechs Größenordnungen (z.B. ±1 nl/s – ±1 ml/s) erweitert werden. n

* Dr. C. Fütterer: Biophysical Tools GmbH, 04317 Leipzig

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