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Influenza und Covid-19 Effizientes Monitoring von Influenza-Medikamenten in Blutplasma

Autor / Redakteur: Dr. Christopher Kuhlmann* / Dr. Ilka Ottleben

Medikamente für die Behandlung von schweren Verläufen einer Influenza-Erkrankung werden in der Zeit der Coronavirus-Pandemie immer häufiger daraufhin getestet, ob sie auch für die Behandlung von Covid-19-Patienten angewendet werden können. Eine neue HPLC-Methode mit nur zwölf Minuten Laufzeit kann die Menge der Influenza-Medikamente in Blutplasma bestimmen, um die Therapie potenziell zu optimieren.

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Abb. 1: Viele Viren basieren auf RNA als Erbsubstanz – die entsprechende Polymerase ist ein Ansatzpunkt für antivirale Medikamente.
Abb. 1: Viele Viren basieren auf RNA als Erbsubstanz – die entsprechende Polymerase ist ein Ansatzpunkt für antivirale Medikamente.
(Bild: ©vchalup - stock.adobe.com)

Der Herbst ist da, die Coronavirus-Pandemie angesichts mangelnder Herdenimmunitäten noch nicht im Griff – und die nächste Grippesaison steht vor der Tür. Auch die Influenza kann für viele Patienten, insbesondere solche mit geschwächtem Immunsystem, hochgefährlich werden und auf der Intensivstation oder gar tödlich enden. Um schwere Verläufe einzudämmen ist es wichtig, effiziente Influenza-Medikamente zu erforschen und zu entwickeln. Prominente Beispiele für diese gegen RNA-Viren wirkenden antiviralen Wirkstoffe sind Remdesivir oder Favipiravir. Durch die Covid-19-Pandemie rückt diese Forschung wieder verstärkt in den Fokus der Gesellschaft, da sie auch bei schweren Covid-19-Verläufen für Linderung sorgen
können.

Das Medikament Favipiravir mit dem Markennamen Avigan ist seit 2014 auf dem Markt. Der Wirkstoff ist ein Guanin-Analogon und gehört zur Klasse der RNA-Polymerase-Inhibitoren [1,2]. Diese Gruppe von Medikamenten verringert bzw. stoppt die Verbreitung des Virus im menschlichen Körper und unterstützt, dass die Erkrankung des Patienten schneller als bei einem nicht behandelten Verlauf abklingt.

Favipiravir sorgt als Inhibitor der viralen RNA-abhängigen RNA-Polymerase dafür, dass die als Ribonukleinsäure (RNA) vorliegende Erb­information des Virus nicht mehr vervielfältigt werden kann und auf diese Weise die Verbreitung im Körper gestoppt oder verlangsamt wird. Insbesondere bei schwer erkrankten Patienten auf Intensivstationen lässt sich mit diesen Medikamenten eine deutliche Symptomerleichterung in Bezug auf Körpertemperatur, Sauerstoffsättigung und Bildgebung der Lunge erzielen. [3]

Einfache und schnelle Methode für den Klinikalltag

Um den therapeutischen Erfolg am Patienten und die Konzentration des Wirkstoffs im Blut in Korrelation zu bringen, verlangt es nach einer Messmethode, die sich im Klinik­alltag einfach, schnell und kosteneffizient für z. B. ein Therapeutisches Drug Monitoring (TDM) einsetzen lässt, also die zeitnahe Medikamentenspiegelbestimmung für Patienten. Die Flüssigchromatographie (HPLC) ist dafür ideal, da sie eine schnelle Trennung von Proben möglich macht und mit empfindlichen Detektoren für geringe Analytkonzentrationen einsetzbar ist. Zudem verlangt sie für die Probenvorbereitung und die Durchführung von Analysen kein Expertenwissen, sondern kann bereits nach lediglich einer Schulung bedient werden.

Um die Kosten für die Analytik pro Patienten zu kontrollieren und die Technik auch einem breiten Anwenderspektrum zu öffnen, wurde bei der Methodenentwicklung bewusst auf ein Massenspektrometer verzichtet. Stattdessen setzten die Entwickler von Shimadzu auf den empfindlichen und selektiven Fluoreszenzdetektor RF-20A. Als Probenquelle diente Blutplasma, um ein möglichst aktuelles Bild von der Medikamentenkonzentration im Patienten in Korrelation zur Wirkung zu erhalten.

Probenvorbereitung und Messbedingungen

Abb. 2: Schematische Abbildung der Probenvorbereitung von Blutplasma-Proben
Abb. 2: Schematische Abbildung der Probenvorbereitung von Blutplasma-Proben
(Bild: Shimadzu Deutschland)

Um Blutproben durch HPLC analysieren zu können, galt es zunächst, die Proteine aus der Probenmatrix zu entfernen, um eine Verstopfung des Analysengeräts zu vermeiden und die vorzeitige Alterung der Trennsäule zu minimieren. Wie in Abbildung 2 schematisch dargestellt, werden hierzu 25 µl Probe mit 100 µl Methanol versetzt und für 30 Sekunden homogenisiert. Das organische Lösungsmittel fällt die Protein­bestandteile aus und die organische Phase extrahiert kleine organische Moleküle wie das Favipiravir. Durch Zentrifugation (15.000 rpm für 7 min) lassen sich die Proteine abtrennen. Für die Analyse werden 10 µl des Überstandes abgenommen und mit 140 µl der mobilen Phase A verdünnt. Im Anschluss ist die Lösung bereit für die Chromatographie.

Tabelle 1: Analytische Messbedingungen
Tabelle 1: Analytische Messbedingungen
(Bild: Shimadzu Deutschland)

Für die Quantifizierung der Favipiravir-Menge wurde die Kali­bration mit einem externen Standard (Alsachim, Illkirch-Graffenstaden, Frankreich) in einer Probenmatrix mit gesundem menschlichem Plasma angesetzt, und auf gleiche Weise die QC-Proben (engl. quality control). Die Trennung fand auf der Nexera XR UHPLC von Shimadzu statt, mit einer Shim-pack Scepter C18-120 Trennsäule mit Vorsäule. Die Methodenparameter für diese Analytik sind in Tabelle 1 gezeigt. Der Gradient aus den mobilen Phasen A und B ist in Tabelle 2 aufgeführt.

Tabelle 2: Gradienten Zeitprogramm
Tabelle 2: Gradienten Zeitprogramm
(Bild: Shimadzu Deutschland)

Um die Qualität der Messergebnisse zu optimieren, wurden bei der Probenvorbereitung Torast-H Glas-Vials eingesetzt, deren spezielles Coating eine besonders geringe Adsorption von Analyten an den Wänden der Probenbehälter erzielt. Das reduziert deutlich die Probenverluste und verbessert die Richtigkeit der Messergebnisse.

Messergebnisse von Favipiravir-Proben

Da biologische Proben typischerweise viele Verbindungen mit UV- absorbierenden Eigenschaften enthalten, ist die Detektion spezifischer Verbindungen in diesen Gemischen eine Herausforderung. Dennoch kann für den fluoreszierenden Analyten Favipiravir der sehr empfindliche und v. a. selektive Fluoreszenzdetektor RF-20A eingesetzt werden, was ein teures Massenspektrometer in dieser Anwendung überflüssig macht. Der Detektor bestrahlt die Probe in der Messzelle mit einer Anregungswellenlänge von 360 nm. Analyten mit fluoreszierenden Eigenschaften treten mit diesem Licht in Wechselwirkung und emittieren im Anschluss wiederum Licht bei einer höheren Wellenlänge. In diesen Fall wird 433 nm als Detektionswellenlänge genutzt.

Während der Methodenentwicklung wurde insbesondere mit Plasmaproben von gesunden Menschen gearbeitet, aufgestockt um eine bestimmte Menge Favipiravir. Hierbei lagen die untersuchten Analyt­konzentrationen immer im Bereich von 1 bis 100 µg/ml, was das therapeutische Fenster [4] des Analyten mit abdeckt. Die externe Kalibration über fünf Kalibrationslevel (1, 10, 25, 50 und 100 µg/ml) zeigte für die aufgestockte Realprobe eine sehr gute Linearität mit einem Bestimmtheitsmaß R2 von 0,999.

Abb. 3: Chromatogramme von Favipiravir in Blutplasma mit Analytkonzentrationen im Bereich von 1 bis 100 µg/ml. Zusätzlich ist das Gradientenprofil der mobilen Phase als Overlay dargestellt.
Abb. 3: Chromatogramme von Favipiravir in Blutplasma mit Analytkonzentrationen im Bereich von 1 bis 100 µg/ml. Zusätzlich ist das Gradientenprofil der mobilen Phase als Overlay dargestellt.
(Bild: Shimadzu Deutschland)

Zudem wurde die Richtigkeit und Präzision der Analysetechnik für den gesamten Messbereich bestimmt. Für alle Konzentrationen ließ sich eine Präzision ermitteln, die eine relative Standardabweichung von 0,18 bis 0,35 Prozent zum vorgegebenen Konzentrationswert zeigt. Die Richtigkeit der Messungen rangierte mit 92,1 bis 106 Prozent für die Kalibrierstandards genau im Akzeptanzbereich von 100 ± 8 Prozent. Chromatogramme, die exemplarisch die Messergebnisse bei den unterschiedlichen Konzentrationen darstellen, sind in Abbildung 3 gezeigt.

Anschließende Validierungstests überprüften die Wiederholbarkeit der Messergebnisse. Die QC-Proben wiesen hierfür eine niedrige (2 µg/ml), mittlere (45 µg/ml) und hohe (90 µg/ml) Konzentration von Favipiravir auf und wurden in einer Sechsfach-Bestimmung (n=6) gemessen. Für den Validationstest ließ sich eine Präzision mit einer relativen Standardabweichung von 0,18 bis 0,35 Prozent bestimmen. Um die Ergebnisrichtigkeit zu ermitteln, wurde der Akzeptanzbereich auf 100 ± 4 Prozent verringert. Die Methode erreichte diesen Wert auch für die drei gemessenen Proben (96,5 bis 100 Prozent).

Mithilfe der vorgestellten Methode konnte das Influenzamedikament Favipiravir erfolgreich in menschlichen Blutplasma-Proben analysiert werden. Durch den Einsatz eines empfindlichen und v. a. selektiven Fluoreszenzdetektors ist es bei dieser Methode möglich, auf kostenintensive Massenspektrometer zu verzichten und eine schnelle Analytik des Medikamentenspiegels im Blut in nur zwölf Minuten zu bestimmen.

Literatur:

[1] Dr. Helga Blasius, veröffentlicht am 28.09.2020 in Deutsche Apotheker
Zeitung, URL: https://www.deutsche-apotheker-zeitung.de/news/artikel/
2020/09/28/was-gibt-es-neues-zu-
favipiravir, Zugriff am 27.08.2021

[2] https://www.bfarm.de/DE/Aktuelles/Schwerpunktthemen/Coronavirus/_node.html, Zugriff am 27.08.2021

[3] Daniela Hüttemann, veröffentlicht am 25.09.2020 in Pharmazeutische Zeitung, URL: https://www.pharmazeutische-
zeitung.de/erfolg-fuer-antiviralen-
corona-wirkstoff-in-phase-iii-120721/, Zugriff am 27.08.2021

[4] Y. Murai, et al. International Journal
of Infectious Diseases, Volume 106,
May 2021, Pages 33-35. (https://doi.org/10.1016/j.ijid.2021.03.048)

* Dr. C. Kuhlmann, Shimadzu Deutschland GmbH, 47269 Duisburg

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