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Bioprozess-Steuerung Einfach unter Kontrolle: Bioprozess-Steuerung mit vorkonfigurierten Kontrollstrategien

Autor / Redakteur: Ulrike Becken* / Dr. Ilka Ottleben

Die Bedienung eines Bioprozess-Controllers ist für Neulinge nicht leicht zu erlernen, und Lehrbücher und Benutzerhandbücher können praktische Erfahrung allenfalls teilweise ersetzen. Vorkonfigurierte Kontrollstrategien können dem Einsteiger schnell zu ersten Erfolgen bei der Bioprozess-Steuerung verhelfen.

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Abb. 1: Bioflo 120 Bioprozess-Steuerungseinheit mit Oberfläche für den Auto-Culture-Modus
Abb. 1: Bioflo 120 Bioprozess-Steuerungseinheit mit Oberfläche für den Auto-Culture-Modus
(Bild: Eppendorf AG / 2016 Matthew C. Abourezk)

Die Bioprozesstechnik ermöglicht die technische Anwendung biologischer Abläufe. Verschiedene Organismen und Zelltypen, wie Bakterien, Pilze, Säugerzellen oder Pflanzenzellen, lassen sich zur Herstellung von pharmazeutischen Wirkstoffen, Lebensmittelzusätzen oder Biokraftstoffen nutzen. Damit dies effizient funktioniert, benötigen die Produktionsorganismen optimale Wachstumsbedingungen. In einem Bioprozess müssen daher verschiedene Parameter, wie die Temperatur, der pH-Wert des Mediums und die Gelöstsauerstoffkonzentration, überwacht und reguliert werden.

In der Praxis kann dies sehr komplex sein und insbesondere der wenig erfahrene Anwender sucht unter Umständen Rat: „Welche Sollwerte sollte ich wählen und wie stelle ich Regelkreise ein, damit die tatsächlichen Prozesswerte so nahe wie möglich an den Sollwerten liegen?“ Nun, das hängt von der Situation ab. Der Anwender muss berücksichtigen, welchen Organismus er kultivieren möchte, in welcher Art von Gefäß und so weiter.

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Nehmen wir als Beispiel die Kontrolle der Gelöstsauerstoffkonzentration im Kulturmedium. In aeroben Prozessen ist diese entscheidend, um eine ausreichende Sauerstoffversorgung der Zellen oder Mikroorgansimen sicherzustellen. Wieviel Sauerstoff in das Medium gelangt, hängt von verschiedenen Variablen ab. Neben der Begasungsrate spielen beispielsweise die Rührgeschwindigkeit und die Sauerstoffkonzentration in der zugeführten Gasmischung eine Rolle. Alle diese Parameter können variiert werden, um die Gelöstsauerstoffkonzentration im Kulturmedium am Sollwert zu halten, doch welche Variationen sinnvoll sind, hängt vom gegebenen Bioprozess ab. In mikrobiellen Prozessen erhöhen Wissenschaftler den Sauerstoffeintrag in das Medium häufig über Kaskaden. Zuerst werden die Rührgeschwindigkeit und anschließend die Begasungsrate und der Sauerstoffanteil in der Gasmischung erhöht. Für empfindliche Säugerzellen hingegen ist ein Protokoll, das die Rührgeschwindigkeit und damit den Scherstress niedrig hält, besser geeignet. Und es wird noch komplexer, weil zur Optimierung der Rührgeschwindigkeit und Begasung weitere Faktoren, wie Gefäßtyp, Gefäßgröße sowie Anzahl und Typ der Rührer berücksichtigt werden müssen.

Bioprozesse schnell starten

Hier setzten vorkonfigurierte Kontrollstrategien an. Bei der Entwicklung des Eppendorf Bioflo 120 Bioprozess-Controllers wurde dessen Steuerungssoftware mit Auto-Culture-Modi ausgestattet. In diesen Modi kann der Anwender entweder ein vordefiniertes E. coli Batch-Fermentationsprotokoll oder ein CHO Batch-Zellkulturverfahren auswählen und mit einem Knopfdruck starten (s. Abb. 1). Die Auto-Culture-Modi sind bereits vorab mit Sollwerten und Kaskaden versehen, die vom Eppendorf Anwendungs- und Entwicklungsteam empfohlen wurden. Diese Werte repräsentieren Expertenwissen, das über hunderte von Versuchen in Eppendorfs Labor für Anwendungsentwicklung gewachsen ist. Der Anwender muss lediglich Gefäßgröße und -typ aus einer Liste auswählen und dann die üblichen Vorbereitungen für den Lauf treffen (Sensoren- und Pumpenkalibrierung, Vorbereitung des Gefäßes). Die Auto-Culture-Modi ermöglichen es dem Anwender, schnell und einfach erste Kulturerfolge bei gleichzeitig minimaler Lernkurve zu erzielen. Alle Sollwerte und Betriebsarten können angepasst, optimiert und als anwenderdefinierte Rezepte gespeichert werden. Diese werden dann zum zukünftigen Gebrauch in der Auto-Culture-Bibliothek gesammelt.

Aber was genau macht der Auto-Culture-Modus? Und wie gut funktioniert er? Im Folgenden werden die Einstellungen in diesem Modus für die Kultivierung für E. coli betrachtet und die Ergebnisse einer Batch-Fermentation eines GFP-exprimierenden Stammes gezeigt, die im Eppendorf-Anwendungslabor in Enfield/USA durchgeführt wurden.

Vorbereitung der Bioprozesse in drei Schritten

Der Prozessstart im Auto-Culture-Modus verläuft in drei Schritten. Zuerst werden Kontrollstation und Gefäß vorbereitet und dann die Kultivierung gestartet.

  • 1. Für den hier beschriebenen Test wurde ein autoklavierbares Glasgefäß mit Heizmanschette und Direktantrieb mit einem Arbeitsvolumen von 2 L verwendet und dieser Gefäßtyp in der Steuerungssoftware aus einer Dropdown-Liste ausgewählt. pH- und DO-Sensoren sowie die Pumpen wurden anschließend gemäß der Bedienungsanleitung kalibriert. Die Hardware-Konfiguration der Bioprozess-Kontrollstation ist in Tabelle 1 zusammen­gefasst.
  • 2. Das Gefäß wurde mit 2 L Kulturmedium befüllt und sterilisiert. Es wurde dann eine Vorratsflasche mit 25 % (v/v) Ammoniumhydroxid für die pH-Kontrolle mit Pumpe 1 des Controllers und dem Gefäß verbunden. Die Kultur wurde mit 5 % des initialen Arbeitsvolumens inokuliert.
  • 3. Zum Start der Kultivierung wurde der Auto-Culture-Modus für E. coli in der Kontrollsoftware gestartet. Nach Bestätigung, dass die Sensoren kalibriert wurden, begann der Prozess und alle relevanten Sollwerte und Kontroll-Loops wurden automatisch eingestellt. Die Einstellungen sind in Tabelle 2 zusammengefasst.
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O2-Versorgung sicherstellen

In Fermentationsprozessen ist die Sauerstoffversorgung oft der limitierende Faktor. Deshalb wurde besonderes Augenmerk darauf gelegt, dass der Auto-Culture-Modus angemessen auf den O2-Bedarf der Kultur reagiert. Üblicherweise optimiert der Anwender im Zuge der Prozessentwicklung Kontrollkaskaden, die Rührgeschwindigkeit, Begasungsrate und Sauerstoffanteil in der Gasmischung steuern und so die Gelöstsauerstoffkonzentration im Medium regeln. Der Auto-Culture-Modus erleichtert dies, indem er für jede Gefäßkonfiguration eine getestete Kaskade liefert, die bei Programmstart automatisch aktiviert wird. Die Kaskade für das hier gewählte Glasgefäß ist in Abbildung 1 gezeigt. Wenn die Gelöstsauerstoffkonzentration den Sollwert unterschreitet, wird zuerst die Rührgeschwindigkeit bis auf maximal 1200 rpm erhöht. Reicht dies zum Erreichen des Sollwerts nicht aus, wird die Begasungsrate von null Standardliter pro Minute (SLPM) auf maximal 2,2 SLPM gesteigert. Bei Bedarf wird anschließend der Anteil von Sauerstoff am zugeführten Gasgemisch bis auf 100 % erhöht. All das geschieht automatisch, ohne dass der Anwender eingreifen muss.

Test aufs Exempel

Im vorliegenden Test wurde ein GFP-exprimierender E. coli Stamm kultiviert. Um den Fermentationserfolg zu kontrollieren, wurde stündlich eine Probe entnommen und über die Messung der optischen Dichte (OD600) das Zellwachstum verfolgt. Um die Proteinexpression zu quantifizieren, wurde die Produktion von GFP ermittelt. Dazu wurden die Bakterien lysiert und das GFP im Überstand mittels eines Eppendorf Biospectrometer Fluoreszenz-Photometers quantifiziert.

Wie in Abbildung 3 gezeigt, erreichte die OD600 innerhalb von sechs Stunden einen Wert von 14. Es wurden bis zu 650 relative Fluoreszenzeinheiten GFP pro mL produziert. Da in diesem Batch-Prozess keine Nährstoffe zugefügt wurden, sank deren Konzentration und die Kultur erreichte nach etwa sieben Stunden die stationäre Phase. Solch eine Wachstumskurve ist für einen Batch-Fermentationsprozess typisch und liefert wichtige Informationen zur Etablierung eines Fed-Batch oder eines kontinuierlichen Bioprozesses. In vorliegenden Fall wuchs der Bakterienstamm bei 37 °C und einem pH von 7,0 zufriedenstellend. Wenn das Experiment andere Sollwerte erfordert hätte, wären Änderungen jederzeit möglich gewesen.

Geänderte Protokolle können gespeichert und mit einem Knopfdruck wieder aufgerufen werden. So entsteht über die Zeit eine Bibliothek mit benutzerdefinierten Protokollen. n

* U. Becken: Eppendorf AG Bioprocess Center, 52428 Jülich

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