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Salmonellen Einsatz der Real-Time-PCR in der Salmonellen-Analytik

Autor / Redakteur: Martine Simon*, Paul Andrei*, Cordt Grönewald**, Hans-Henno Dörries**, Gido Murra**, Constanze Klopfleisch**, Thomas Bergmann** und Benjamin Junge** / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Mehr als 28.000 Lebensmittelproben wurden am Offenburger BAV-Institut in 23 Monaten untersucht. Durch den Einsatz eines Real-Time-PCR-Systems inklusive automatischer Probenaufarbeitung konnten Ergebnisse schneller und mit geringerer Fehleranfälligkeit ermittelt werden.

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Abb.1: Vergleich der Workflows beim molekularbiologischen und mikrobiologischen Nachweis (nach ISO 6579) von Salmonella
Abb.1: Vergleich der Workflows beim molekularbiologischen und mikrobiologischen Nachweis (nach ISO 6579) von Salmonella
(Bilder: Biotecon Diagnostics)

Die Real-Time Polymerasekettenreaktion (Real-Time-PCR) hat sich als sehr schnelle und zuverlässige Methode für die Detektion und Identifizierung von Pathogenen wie Salmonella in Lebensmitteln etabliert. Im Gegensatz zum klassisch-kulturellen Verfahren verkürzt sich die Untersuchungszeit bei Anwendung der molekularbiologischen Methode stark. Die Real-Time-PCR wird daher als Schnellmethode eingesetzt, um im stetig wachsenden und vielfältiger werdenden Bereich der Lebensmittelproduktion die Sicherheit der Erzeugnisse zu garantieren. Durch die spezifische Bindung von Primern und Sonden an das DNA-Zielmolekül zeichnet sich die Real-Time-PCR zudem durch eine hohe Sensitivität und Spezifität aus [1].

Biotecon Diagnostics entwickelt unter der Produktlinie foodproof seit mehr als 15 Jahren für die wichtigsten Lebensmittelpathogene Real-Time-PCR-Kits und bietet auch automatisierte Systemlösungen zur Probenbearbeitung für Lebensmittellabore mit hohem Probendurchsatz an. Die Routinetauglichkeit und Robustheit der automatisierten Probenaufarbeitung von Biotecon Diagnostics wurde in einer Kooperation mit dem BAV-Institut in einer Langzeitstudie untersucht.

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Das BAV-Institut ist eines der größten und modernsten Dienstleistungslabore für mikrobiologische Untersuchungen von Lebensmitteln in Deutschland mit mehr als 1000 Kunden. Neben Lebensmitteltestungen werden auch Proben aus der Pharma- und Kosmetikbranche untersucht. Die wichtigste und am häufigsten untersuchte Gruppe der pathogenen Lebensmittelerreger ist die Gattung Salmonella. Die gram-negativen Bakterien der Gattung Salmonella gehören zur Familie der Enterobacteriaceae und verursachen bei Menschen die Erkrankung der Salmonellose, eine der häufigsten durch verunreinigte Lebensmittel bedingte Erkrankung in Deutschland [2].

Im Folgenden wird der routinemäßige Nachweis von Salmonella unter Anwendung des foodproof Salmonella Detection Kits in Kombination mit dem foodproof Magnetic Preparation Kit I und dem foodproof Roboprep+ HT 150-8 vorgestellt. Die automatisierte Probenvorbereitung mit PCR-Setup sowie der anschließende Erregernachweis mittels Real-Time-PCR ist seit 2013 eine von Microval gemäß ISO 16140 sowie vom AOAC-RI zertifizierte Methode [3, 4].

Material und Methoden

Im Zeitraum Juli 2012 bis Mai 2014 wurden im BAV-Institut 28 490 Proben auf Erreger der Gattung Salmonella untersucht. Neben Fleisch- und Wurstproben wurden auch Salate, Süßspeisen, Eiscreme, Feinkost- und Fischerzeugnisse untersucht (s. Abb. 1).

Probenanreicherung und DNA-Extraktion: Für die Anreicherung wurde 25 g des Ausgangsmaterials mit 225 ml gepuffertem Peptonwasser vermischt und für 19 bis 20 h bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden 8 ml der Suspension in ein Falcon-Röhrchen transferiert. Um den hohen Durchsatz von Proben zu bewältigen, erfolgte im Labor des BAV-Instituts die DNA-Extraktion automatisiert durch den foodproof RoboPrep+ HT 150-8 unter Einsatz des foodproof Magnetic Preparation Kit I.

Nachweis von Salmonella: Für den molekularbiologischen Nachweis des pathogenen Erregers wurde das foodproof Salmonella Detection Kit, basierend auf dem Einsatz von Hybridisierungssonden, unter Verwendung des Roche Lightcycler 480 eingesetzt. Das Kit enthält eine interne Amplifikationskontrolle, um die Korrektheit negativer PCR-Ergebnisse sicher zu stellen. Wie der Arbeitsablauf in Abbildung 1 zeigt, ist somit inklusive Anreichung der Proben ein PCR-Ergebnis für den Nachweis von Salmonella innerhalb von 24 h möglich. Positive Proben werden anschließend kulturell bestätigt. Mit der kulturellen Referenzmethode ISO 6579 benötigt man für Salmonella Untersuchungen mindestens drei Tage und bei positiven Proben mindestens vier Tage.

Ergebnisse

Von den 28 490 untersuchten Lebensmittelproben war bei 237 Proben das Ergebnis nicht auswertbar und musste wiederholt werden bzw. wurde mittels der klassischen Mikrobiologie bestimmt. Dies bedeutet, dass 99,17 % der Proben durch die molekularbiologische Methode ausgewertet werden konnten.

Bei 159 Proben trat ein positives PCR-Ergebnis auf. Diese Proben wurden anschließend mit der kulturellen Referenzmethode ISO 6579 untersucht. Dabei konnte für den Großteil der Proben (n=97) das Ergebnis der PCR durch einen positiven mikrobiologischen Befund bestätigt werden. Bei 62 Proben konnten die positiven PCR-Ergebnisse kulturell nicht bestätigt werden. Dies entspricht einem Anteil von 0,21 % an der Gesamtprobenanzahl (s. Tab. 1). Der typische Verlauf der Amplifikationskurven in der Real-Time-PCR mit dem foodproof Salmonella Detection Kit ist in Abbildung 3 exemplarisch dargestellt.

Diskussion

Der Einsatz des foodproof Salmonella Detection Kits ist nicht nur eine sehr schnelle, sondern auch eine der sichersten Methoden um Salmonella in Lebensmitteln nachzuweisen. Das American Proficiency Institute veröffentlichte eine Studie über die Anzahl falsch positiver Testergebnisse bei Ringversuchen in der mikrobiologischen Lebensmitteluntersuchung. Dabei wurden Daten von 1999 bis 2012 erfasst. Die Studie zeigt, dass in diesem Zeitraum durchschnittlich 4,9 % der Salmonella-spp.-Proben als falsch positiv bewertet wurden [5]. Die zwischen Juli 2012 und Mai 2014 erhobenen Daten am BAV-Institut ergaben dagegen einen Anteil von 0,21 % nicht kulturell bestätigter Proben, sowie einen insgesamt nicht auswertbaren Probenanteil von unter 2 %.

Dies ergänzt die Microval- und AOAC-Validierungsdaten, welche eine relative Genauigkeit von 98 % für das Verfahren zeigen [3], [4]. Beide Ergebnisse unterstreichen die Zuverlässigkeit der Real-Time-PCR-Methode im Lebensmittelbereich.

Literatur

[1] Schneider, A.; Grönewald, C.; Fandke, M.; Kurth, B.; Barkowski, S.; Berghof-Jäger, K.: Real-Time Detection of the Genus Salmonella with the LightCycler System;Biochemica 4/2002

[2] Robert Koch-Institut: Infektionsepidemiologisches Jahrbuch für 2012, Berlin, 2013

[3] MicroVal (2013, Certificate 2011-LR40)

[4] AOAC (AOAC-RI PTM Certificate # 120301)

[5] C. C. Snabes, D. C. Edson, S. Empson, L. D. Massey: Pathogen Detection in Food Microbiology Laboratories: An Analysis of Proficiency Test Performance. 113th General Meeting of the American Society of Microbiology, 2013.

* M. Simon, P. Andrei:BAV Institut Hygiene und Qualitätssicherung GmbH, 77656 Offenburg

* *C. Grönewald, H.-H. Dörries, G. Murra, C. Klopfleisch, T. Bergmann, B. Junge:BIOTECON Diagnostics GmbH, 14473 Potsdam

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