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Einzelzell-Analyse Einzigartige Zellen: Computerbasierte Methoden verbessern die Einzelzell-Analyse

Autor / Redakteur: Anna Sacher* und Fabian Theis* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Moderne Wirkstoffforschung wird immer komplexer. Um Vorgänge zu verstehen, muss immer öfter der Mechanismus in einzelnen Zellen beobachtet werden. Lesen Sie, wie mathematische Methoden hier unterstützend eingreifen und damit zu neuen Einblicken verhelfen können.

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Übersicht über die entwickelten Software Tools zum Tracken und Quantifizieren einzelner Zellen
Übersicht über die entwickelten Software Tools zum Tracken und Quantifizieren einzelner Zellen
(Bild: Hilsenbeck et al, Nat. Biotechn. 2016 [2])

In vielen Bereichen der medizinischen und biologischen Forschung steht das Verständnis der Grundlagen zellbiologischer Vorgänge im Mittelpunkt – sei es in der Krebsforschung, bei neurogenerativen Krankheiten oder bei Autoimmunerkrankungen wie Diabetes. Zellbiologische Fragestellungen zu lösen, ist in vielerlei Hinsicht eine große Herausforderung. Die Komplexität der Zelle ist dabei entscheidend. Sie besteht aus einer Vielzahl von verschiedenen Molekülen die interagieren, Signale weiterleiten und Abläufe regulieren. Was aber genau bestimmt die Identität einer Zelle?

In klassischen Experimenten analysiert man die Zelloberfläche z.B. mit bestimmten Markern und legt anhand dessen den Zelltyp fest. Aber sind es nicht vielmehr die Vorgänge, die verborgen im Zellinneren stattfinden, die ihre Identität bestimmen, da diese das Verhalten der Zelle dirigieren?

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In einer scheinbar homogenen Zellpopulation können trotz identischer DNA enorme Unterschiede im Zellverhalten entstehen. Experimentelle Ergebnisse, die auf dem Mittelwert von Zellpopulation beruhen, spiegeln einen biologischen Prozess daher häufig nicht adäquat wieder. Oft ist es entscheidend, seltene Zelltypen erkennen zu können, die sich von dem Großteil der Population unterscheiden – beispielsweise resistente Tumor­zellen nach der Therapie – oder Zellen zu identifizieren, die sich in einem bestimmten Stadium des Zellzyklus befinden. In den letzten Jahren haben so genannte Einzelzellanalysen entscheidend dazu beigetragen, Zellvorgänge detaillierter betrachten zu können.

Durch Einzelzellanalysen ist es möglich, jede Zelle für sich zu betrachten und zu analysieren, mittlerweile auf der Skala ganzer Gewebeausschnitte. In einem einzelnen Experiment können Genexpressionswerte von tausenden einzelnen Zellen gemessen werden. Die Labortechniken dazu haben sich in den letzten Jahren enorm weiterentwickelt. Daraus ergeben sich große Herausforderungen in der Analytik. Hier entstehen enorme Mengen von Daten (Big data), die integriert und analysiert werden müssen. Dies geschieht mithilfe klassischer Statistik, Machine Learning, sowie moderner Methoden der computerbasierten Biologie. Erst durch Anwendung dieser fortgeschrittenen Methoden werden viele biologische Aspekte der komplexen Einzelzelldaten sichtbar. Gewonnene Einblicke in die Vorgänge der Zellbiologie können in der Therapie von Krankheiten, wie Krebs oder neurogenerativen Krankheiten, genutzt werden.

Mathematik findet verborgene Zell-Subtypen

In Zusammenarbeit mit dem „European Bioinformatics Institute“ (EBI, Stegle und Marioni Labs) ist es Helmholtz-­Wissenschaftlern gelungen, anhand klassischer statistischer Methoden, verborgene Zell-Subtypen in einer Zellpopulation zu identifizieren [1]. Um verschiedene Zelltypen zu bestimmen, wird das jeweilige aktive Erbgut – in Form von RNA-Molekülen – der einzelnen Zellen quantitativ analysiert. Diese Einzelzellanalyse liefert ein exaktes Bild einzelner Zell­typen. Allerdings können Störfaktoren, wie eine kurzfristig veränderte Genexpression, bedingt durch den Zellzyklus oder Differenzierungsprozesse, das Ergebnis beeinflussen.

Die Forscher haben dazu ein bioinformatisches Modell entwickelt, das solche Unsicherheitsfaktoren statistisch ermittelt und in der Analyse einzelner Zellen berücksichtigt. In der besagten Studie konnte gezeigt werden, wie störende Faktoren herausgerechnet werden können und dadurch ein unverfälschtes Bild der unterschiedlichen Zelltypen erhalten. Durch die Kombination von Einzelzellanalysen mit statistischen Methoden können daher Zellen identifiziert werden, die sonst unentdeckt bleiben.

Zum Beispiel gelang es mit obigem so genannten single-cell latent variable Model (scLVM), unterschiedliche Reifestadien von T-Zellen in ihrer Entwicklung hin zu Th2-Zellen zu detektieren und zu charakterisieren. T-Zellen sind Immunzellen, die in verschiedene Unterformen, beispielsweise Th2-Zellen (T-Helferzellen Typ2), ausdifferenzieren, um verschiedene Abwehrfunktionen auszuüben.

Software analysiert Zeitraffer-Mikroskopiefilme

In Zusammenarbeit mit der ETH Zürich (Schröder Lab) wurde eine frei verfügbare Software entwickelt, die es erlaubt, einzelne Zellen über Wochen zu beobachten und gleichzeitig molekulare Eigenschaften zu messen [2]. Stammzellforscher und Entwicklungsbiologen interessiert beispielsweise, wie sich Stammzellen zu anderen Zelltypen weiterentwickeln. Da sich solche Prozesse aber teilweise über mehrere Tage erstrecken, ist die Beobachtung einzelner Zellen nicht einfach. Die vorgestellte Lösung besteht im Aufzeichnen und Analysieren so genannter Zeitraffer-Mikroskopiefilme. Ein solcher Film besteht aus vielen Einzelbildern. Da sich die Zellen von einem Bild zum anderen nur geringfügig bewegen, können einmal identifizierte Zellen quasi kontinuierlich beobachtet werden.

Die Auswertung der Zeitrafferfilme ist jedoch nicht trivial: Auf der einen Seite müssen genug Bilder aufgenommen werden, um die Zellen nicht aus den Augen zu verlieren, auf der anderen Seite entstehen so enorme Datenmengen mit teilweise Millionen von Bildern. Es geht also darum, diese Datenmengen für die Wissenschaft verwertbar zu machen. Wir haben zwei separate Pakete geschnürt: ein manuelles Trackingtool und ein halbautomatisches Quantifizierungstool für Einzelzellanalysen in Zeitraffer-Mikroskopiefilmen. Beide zusammen erlauben die Messung von Eigenschaften wie etwa Länge des Zellzyklus, die Expressionsdynamik bestimmter Proteine oder Korrelationen dieser Eigenschaften zwischen Schwesterzellen [3].

Algorithmus eröffnet Einblicke in die Zelldifferenzierung

Auch um Entwicklungsprozesse von Zellen, zum Beispiel Zelldifferenzierung, besser zu verstehen ist die Einzelzellanalytik eine Bereicherung in der Forschung. Ein Beispiel dafür ist die Bildung verschiedener Typen von Blutzellen aus ihren Vorläufern, den Blutstammzellen. Um zu verstehen, wie dieser Prozess genetisch gesteuert wird, ist die Analyse der abgelesenen Gene, das so genannte Transkriptom, wichtig. Die Tatsache, dass man seit kurzem das Transkriptom einer einzelnen Zelle bestimmen kann, ist für viele Forschungsfelder revolutionär. Jedoch ist wiederum die Herausforderung, diese Daten richtig zu interpretieren – auch hier helfen mathematische und statistische Methoden. In der Entwicklungsbiologie sehen wir beispielsweise, dass nie alle Zellen einer Probe gleichzeitig und synchron auf bestimmte Ereignisse reagieren. Daher brauchen sie auch unterschiedlich lange für bestimmte Entwicklungsschritte. Es handelt sich also um ein dynamisches Gemisch. Aus einem solchen Gemisch einen kontinuierlichen Prozess zu konstruieren, ist schwer, zumal die Zellen nur für eine Messung zur Verfügung stehen. Man misst beispielsweise an einem einzelnen gegebenen Zeitpunkt eine Blutprobe und erhält damit eine Momentaufnahme von einem Gemisch von Zellen aus verschiedenen Entwicklungsstadien. Um die Entwicklungsprozesse aus so einer Momentaufnahme zu rekonstruieren, haben wir einen Algorithmus namens Diffusion Pseudotime entwickelt. Dieser ordnet Zellen auf einer virtuellen Zeitachse – der Pseudozeit – entlang derer sie kontinuierliche Veränderungen im Transkriptom aufweisen. Dadurch lässt sich rekonstruieren, welche Gene nacheinander abgelesen werden. Forscher können damit auch grafisch darstellen, wie sich die Entwicklungspfade unterschiedlicher Zelltypen verzweigen (s. Abb. 2).

Die Forscher konnten so zeigen, wie sich ein relativ einheitlicher Verband von Blutstammzellen zu unterschiedlichen Zelltypen entwickelt. Während die einen zu roten Blutkörperchen werden, differenzieren andere z.B. zu endothelartigen Zellen. Zudem erhalten Wissenschaftler Informationen darüber, welche Genschalter hinter den Entwicklungen stecken. Der relativ diffuse Mix von Zellen, die sich auf verschiedenen Etappen ihrer Entwicklung befanden, kann so also im Computer entwirrt werden und erlaubt nach der Analyse ein klares Bild auf die ablaufenden Einzelschritte.

Das Ziel der Helmholtz-Experten ist es, die entwickelten Methoden für die Entschlüsselung weiterer Prozesse zu nutzen, die bisher wenig verstanden oder unentdeckt sind. Die bisherigen Erfolge zeigen, dass sie damit vielversprechende Werkzeuge geschaffen haben, die ein breites Anwendungsspektrum besitzen und die wissenschaftliche Forschung enorm bereichern können.

Literatur

[1] Buettner et al: Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single-cell RNA-Sequencing data reveals hidden subpopulation of cells, Nature Biotechnology, DOI: 10.1038/nbt.3102

[2] Hilsenbeck et al: Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties, Nature Biotechnology, 2016

[3] Hoppe et al, Nature, 2016; Filipczyk, A. et al, Nat. Cell Biol., 2015

[4] Haghverdi, L., Büttner, M., Wolf, F., Buettner, F., Theis, F.J. (2016): Diffusion pseudotime robustly reconstructs lineage branching. Nat. Methods, DOI: 10.1038/nmeth.3971

* Dr. A. Sacher, Prof. Dr. F. Theis: Institute of Computational Biology, Helmholtz Zentrum München und Technische Universität München, Lehrstuhl für Mathematische Modellierung biologischer Systeme, 85764 Neuherberg

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