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EDC Endokrine Disruptoren effizient in organischer Matrix bestimmen

Autor / Redakteur: Guido Deußing* / Dr. Ilka Ottleben

Um Alkyl- und Bisphenole in einem Analysengang in menschlichen Organen und Körpergewebe zu bestimmen, setzen spanische Wissenschaftler auf die Dual-Stir-Bar-Sorptive-Extraction (SBSE) gekoppelt an die Thermodesorptions-GC/MS.

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Abb. 1: Der bekannteste Vertreter der Bisphenole (BP) ist das Bisphenol A, das z.B. zur Herstellung von Kunststoffen, Harzen, Flaschenverschlüssen und Innenbeschichtungen von Konserven und Wasserrohren eingesetzt wird. (Symbolbild)
Abb. 1: Der bekannteste Vertreter der Bisphenole (BP) ist das Bisphenol A, das z.B. zur Herstellung von Kunststoffen, Harzen, Flaschenverschlüssen und Innenbeschichtungen von Konserven und Wasserrohren eingesetzt wird. (Symbolbild)
(Bild: ©Dmytro S - stock.adobe.com)

Alles im Leben hat zwei Seiten, auch in der Chemie. Alkylphenole (AP) etwa sind in der industriellen Anwendung nützlich, als Monomer für die Produktion von Kunststoffen und Harzen etwa oder als Ausgangsstoff für die Herstellung nichtionischer Tenside. Gelangen die Chemikalien in die Umwelt, was sich im Grunde kaum verhindern lässt, werden sie zur Belastung. Gleiches gilt für Bisphenole (BP), deren bekanntester Vertreter das Bisphenol A ist und das z.B. zur Herstellung von Kunststoffen, Harzen, Flaschenverschlüssen und Innenbeschichtungen von Konserven und Wasserrohren eingesetzt wird.

Unerwünschte Nebenwirkung endokriner Disruptoren

Auf Verbindungen beider Klassen sowie deren Abbauprodukte, die zu den endokrin disruptiven Chemikalien (EDCs) zählen, ist ein strenges analytisches Auge zu richten. Sie besitzen nicht nur hormonaktive Eigenschaften, sondern wirken zum Teil bereits in geringen Mengen toxisch und kanzerogen. Da sie sich natürlichen Abbauprozessen weitgehend entziehen, respektive gefährliche, persistente Stoffwechselprodukte ausbilden, werden sie zum Problem. Über die Nahrung und das Trinkwasser gelangen sie auch in den menschlichen und tierischen Organismus. Diese Tatsache macht sie berechtigterweise zum Gegenstand chemisch-analytischer Untersuchungen.

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Bestehende Methoden

Um eine Bewertung der Exposition des Menschen mit APs und BPs vorzunehmen, werden Lebensmittel, Körpergewebe und -flüssigkeiten untersucht. Während für die Untersuchung wässriger Proben Prozeduren bekannt und etabliert sind, berichten Marta Pastor-Belda und Kollegen im Fachjournal Talanta [1], mangele es an Verfahren für die Bestimmung von APs und BPs in menschlichen und tierischen Proben. Die meisten verwendeten biologische Flüssigkeiten als Probenmatrix. Für die Analyse von APs und BPs würden laut Pastor-Belda et al. unterschiedliche Methoden meist auf Basis chromatographischer Trennverfahren nach vorangegangenen Extraktionen an festen Phasen (SPE, SBSE) oder Flüssig-Flüssig­extraktion (LLE) vorgeschlagen. Keine Methode aber erlaube es, Vertreter beider Gruppen in einem Analysengang zu bestimmen, schrei­ben die Wissenschaftler.

Das zu ändern, hatten sich die Wissenschaftler von der Universität von Murcia in Spanien vorgenommen. Im Fachjournal Talanta berichten sie nun von einem hochempfindlichen und zuverlässigen Analyseverfahren, das sie validiert und erfolgreich in die Anwendung genommen hätten [1].

Die Dual-SBSE-TD-GC/MS

Die von ihnen beschriebene Dual-Stir-Bar-Sorptive Extraktion (Dual-SBSE) mit anschließender thermischer Desorption und Gaschromatographie-Massenspektrometrie (TD-GC/MS) eigne sich dazu, mehrere ausgewählte APs und BPs in nur einem Arbeitsgang sicher, empfindlich und effizient zu bestimmen, und zwar in forensischen Humanproben (Niere, Leber, Herz, Lunge, Milz und Bauchfett), die Leichen bei Obduktionen im Institut für Rechtsmedizin der Universität Murcia in Mengen von fünf Gramm entnommen wurden. Die Dual-SBSE sei ein Extraktionsverfahren, schreiben Pastor-Belda et al., das unterschiedliche Extraktionsbedingungen für ein und dieselbe Probe zulasse: Die Analyten zweier Probenaliquote ließen sich jeweils unter optimalen Bedingungen extrahieren und anschließend zeitgleich analysieren, was im Endeffekt die Gesamtanalysedauer verringere.

Applikative Details

In den Fokus ihrer Bestimmung rückten Pastor-Belda et al. folgende Analyten: Bisphenol F (BPF), Bisphenol A (BPA) und Bisphenol Z (BPZ) sowie 4-tert-Butylphenol (4-TBP), 4-Pentylphenol (4-PP),4-tert-Octylphenol (4-TOP), 4-Hexylphenol (4-HP), 4-Octylphenol (4-OP) und 4-Nonylphenol (4-NP). Als interne Standards (IS) wurden Biphenol (2,2-Dihydroxybiphenyl, BP) zur Quantifizierung der Bisphenole und 5-Brom-2-Chloroanisol (BCA) für die Alkylphenole verwendet. Standardlösungen der einzelnen Verbindungen wurden in Methanol angesetzt.

Nachdem die Forscher verschiedene Verfahren der Probenvorbehandlung wie die Mikrowellen- oder Ultraschall-unterstützte Extraktion (MAE/VAE) getestet und für weniger gut geeignet bewertet hatten, starteten Pastor-Belda et al. ihre Analyse mit einer salzunterstützten Flüssig-Flüssigextraktion (SALLE): Jeweils 0,5 g einer Probe wurde in zwei Probengefäßen vorgelegt sowie mit IS (je 10 ng/g) und 2 ml Wasser versetzt. Die Proben wurden kurz geschüttelt und mit einer geringen Menge Acetonitril sowie 0,5 g Na­triumchlorid (NaCl) dotiert. Die Probe wurde erneut kräftig geschüttelt und zur vollständigen Trennung der Phasen anschließend 3 min zentrifugiert (4000 U/min). Zur weiteren analytischen Verwendung wurden 1,5 mL aus dem Überstand entnommen und mit Wasser auf ein Volumen von 10 mL aufgefüllt und verdünnt.

Die Probenvorbereitung

Um die Polarität der Bisphenole zu reduzieren und deren Flüchtigkeit und letztlich die chromatographische Auflösung zu verbessern, erwies sich laut Pastor-Belda et al. eine Derivatisierung durch Acetylierung als geboten; dieser Schritt habe zu positiven Effekten in puncto Extraktionsfähigkeit im Zuge der SBSE geführt. Hierzu wurde ein 10-mL-Aliquote mit Dikaliumhydrogenphosphat (K2HPO4, 0,3 g) und Acetaldehyd (AA, 200 µL) versetzt. Dieser Schritt zeigte sich bei den Alkylphenolen als weniger wirksam aber auch nicht notwendig. Weil für die jeweiligen EDCs unterschiedliche Extraktionsbedingungen erforderlich waren, habe man sich entschieden, zwei separate Extraktionen durchzuführen unter Einsatz einer zweiten 10-mL-Aliquote, was den Ausschlag gab für die Durchführung der Dual-SBSE, berichten Pastor-Belda et al.

Durchführung der Dual-SBSE

In beide Probengefäße wurde jeweils ein mit Polydimethysiloxan (PDMS) ummanteltes Twister-Rührstäbchen (Gerstel) zur SBSE der acetylierten Bisphenole und der Alkylphenole gegeben. Die SBSE erfolgte unter Rühren für die Dauer von zwei Stunden. Anschließend wurden die beiden Twister-Rührstäbchen den Proben entnommen, trockengetupft und zur thermischen Extraktion der angereicherten Analyten und deren GC/MS-Analyse in ein und dasselbe Thermodesorptionsröhrchen (TD-Röhrchen) eingeführt, das auf dem Autosampler (Gerstel-Multipurpose-Sampler, MPS) positioniert wurde. Alle weiteren Schritte der Analyse erfolgten von da an vollständig automatisiert.

Die TD-GC/MS-Analyse

Der MPS überführt die TD-Röhrchen in die Thermal-Desorption-Unit (Gerstel-TDU 2), in dem die Analyten temperaturprogrammiert (50 °C [0,2 min] – 200 °C/min – 275 °C [10 min]) ausgeheizt und im Splitlos-Modus mittels eines Trägergasstroms (Helium, 45 mL/min) auf das Kaltaufgabesystem (Gerstel-KAS) des Gaschromatographen (Agilent 6890N) überführt und bei 15 °C fokussiert wurden. Nach Abschluss dieses Prozesses wurden die Analyten vom KAS temperaturprogrammiert (15 °C – 6 °C/min – 275 °C [4 min]) im konstanten Heliumgasstrom (1 mL/min) auf die GC-Säule (HP-5MS, 30 m x 0,25 mm, 0,25 µm) überführt. Die Temperatur des GC-Ofens betrug zu Anfang 80 °C und wurde nach 0,5 min mit 20 °C/min auf 200 °C (6 min) hochge­fahren; die Temperatur der Ionenquelle betrug 230 °C, die der Transferleitung 300 °C und die des Quadrupol-MS (Agilent 5973) 150 °C. Die Gesamtdauer der TD-GC/MS-Bestimmung der ausgewählten Alkyl-phenole und Bisphenole betrug laut Pastor-Belda et al. 16,5 min.

Validierung der Methode

Die Forscher validierten ihre Dual-SBSE-TD-GC/MS-Methode gemäß internationaler Richtlinien, bestätigen damit die Tauglichkeit der ausgewählten internen Standard-Sub­stanzen (s.o.) und kalibrierten sie über sechs Stufen im Konzentrationsbereich von 0,5 bis 50 ng/g in den verschieden Organ- und Gewebeproben. Die Wiederholbarkeit wurde laut Pastor-Belda et al. durch dreifache Analyse zweier Proben (n = 9) am selben Tag bestimmt und ergab eine Standardabweichung (RSD) zwischen 2,2 und 13% für Alkylphenole sowie 1,8 und 10% für die Bisphenole. Die Reproduzierbarkeit der Analyse von Tag zu Tag wurde über drei Tage aufgezeichnet (n = 9) und ergab eine RSD von 5,5 bis 11% beim Nachweis der Alkylphenole und entsprechende Werte von 9,1 bis 14% für die Bisphenole.

Für die Bestimmung der RSDs und damit für die Überprüfung der Präzision ihrer Methode verwendeten die spanischen Wissenschaftler der Abteilung für Analytische Chemie und des Instituts für Rechtsmedizin der Universität Murcia zwei unterschiedliche Matrices, und zwar Proben entnommen aus den Organen Gehirn und Herz. Die Wiederfindungsraten rangierten zwischen 85,5 und 115% (APs) respektive 83,6 und 120% (BPs). Die Bestimmungsgrenzen lagen für APs zwischen 0,05 und 4,0 ng/g und für die BPs zwischen 0,26 und 2,6 ng/g.

EDC-Akkumulation im Körper

Wie Pastor-Belda et al. bemerkten, habe ihre Untersuchung menschlicher Organe und Gewebe auf EDCs, die im Rahmen forensischer Obduktionen entnommen wurden, einige bemerkenswerte Besonderheiten ergeben. Zum einen habe sich in allen Proben wenigstens eine der analysierten Verbindungen nachweisen lassen. Bisphenol A (BPA) und 4-tert-Octylphenol (4-TOP) seien die EDCs mit den höchsten Konzentrationen gewesen, berichten die Forscher. Zudem habe sich herausgestellt, dass sich 4-TBP und BPZ insbesondere im Gehirn anreicherten, während 4-TOP, 4-HP, 4-OP und 4-NP die Tendenz zeigten, im Bauchfett zu akkumulieren. Weiterhin habe sich ergeben, dass APs sich vorwiegend im Bauchfett ablagern, BPs wiederum eher im Gehirn [1].

Pastor-Belda et al. kommen nach Auswertung aller Daten zu dem Schluss, dass es ihnen unter Anwendung der Dual-SBSE mit anschließender Thermodesorptions-GC/MS gelungen sei, chemisch unterschiedliche EDCs, namentlich ausgewählte APs und BPs, mit hoher Empfindlichkeit zuverlässig und effizient in menschlichen Organen und Geweben in nur einem Analysengang nachzuweisen. Dies sei das erste Mal gewesen, schreiben die Forscher, dass im Rahmen der rechtsmedizinischen Obduktion entnommenes Humangewebe auf akkumulierte EDCs untersucht worden sei.

Literatur:

[1] Pastor-Belda et al., Dual stir bar sorptive extraction coupled to thermal desorp­tion-gas chromatography-mass spectrometry for the determination of endocrine disruptors in human tissues, Talanta 207 (2020) 120331, https://doi.org/10.1016/j.talanta.2019.120331

* G. Deußing: Redaktionsbüro Guido Deußing, 41464 Neuss

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