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Mikroplatten-Assay Ergebnisse zellbasierter Mikroplatten-Assays verbessern

Autor / Redakteur: Franka Maurer* / Dr. Ilka Ottleben

Lange Messzeiten und der Verlust von Anregungs- und Emissionslicht sind Schwachstellen bei der Untersuchung zellbasierter Assays. Eine neu entwickelte Messtechnologie in Mikroplatten-Readern verbessert beide Komponenten, spart Zeit und liefert bessere Messergebnisse.

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Abb. 1: Zellmigrations-Assay in einer 96-well-Mikroplatte. Aufnahme einer Bildmatrix, gemessen von unten. Ein deutlicher Trend zeigt von links nach rechts die Zunahme an Zellen, die in die Mitte migrieren; verdeutlicht durch die Abnahme schwarzer Bildpunkte.
Abb. 1: Zellmigrations-Assay in einer 96-well-Mikroplatte. Aufnahme einer Bildmatrix, gemessen von unten. Ein deutlicher Trend zeigt von links nach rechts die Zunahme an Zellen, die in die Mitte migrieren; verdeutlicht durch die Abnahme schwarzer Bildpunkte.
(Bild: BMG Labtech)

Im Jahr 2008 erhielten Osamu Shimomura, Martin Chalfie und Roger Y. Tsien den Nobelpreis für die Entdeckung und Weiterentwicklung des grün fluoreszierenden Proteins (GFP). Seit der Isolation des GFP aus der Quallen-Art Aequorea victoria in den frühen 60er-Jahren und dessen späterer Klonung wurden hunderte verschiedene Fluorophore und Farbstoffe für den Einsatz in biologischen, biochemischen und Life-Science-Applikationen entwickelt.

Heute gehört Fluoreszenz zu den meist genutzten Detektionsmethoden in der Forschungsarbeit und ermöglicht die Untersuchung einer Vielzahl von zellbasierten Prozessen in Echtzeit. Darunter fallen u.a. die Erforschung von intrazellulärem Transport, Protein-Signalen, Rezeptor-Desensibilisierung, Zellbewegungen, Zellmigration, Zellteilung, Zelltod, Stoffwechsel, Differenzierung, Chemotaxis und vielen weiteren Prozessen. Die Nobelpreis-Auszeichnung und die Weiterentwicklung der Fluorophore führten zu einem Fortschritt der instrumentellen Analytik auf diesem Gebiet und eröffneten vielen Life-Science-Laboren den Zugang zu neuen Instrumenten.

Geschwindigkeit der Messung als limitierender Faktor

Mit dem konfokalen Mikroskop gelangen Wissenschaftlern fantastische Aufnahmen biologischer Prozesse. Durch die Markierung mit dem grün fluoreszierenden Protein werden intrazelluläre Prozesse sichtbar gemacht und Bilder und Videosequenzen in Echtzeit aufgezeichnet.

Ein Nachteil des konfokalen Mikroskops ergibt sich jedoch aus langen Messzeiten für den Erhalt reproduzierbarer und zuverlässiger Daten. Es kann jeweils nur eine Zelle oder ein Zellcluster zeitgleich betrachtet werden.

Als zweites Instrument wurde das Durchflusszytometer verstärkt in Life-Science-Laboren eingesetzt. Spezielle Durchflusszytometer können fluoreszenzmarkierte Zellen je nach Streulicht- und Fluoreszenzemission in unterschiedliche Reagenzgefäße sortieren, was als FACS-Analyse bezeichnet wird (aus dem Englischen Fluorescence-Activated Cell Sorting).

Die FACS-Analyse wird hauptsächlich in High-Throughput-Screening- (HTS) und High-Content-Screening- (HCS) Laboren durchgeführt. Dabei werden heterogene Zellgemische in homogene Untergruppen sortiert, wobei sowohl die fluoreszierenden Zellen als auch die nicht markierten Zellen gezählt werden. Die FACS-Analyse ermöglicht durch die automatische und zuverlässige Zählung der markierten Zellen in vielen, schnell aufeinanderfolgenden Einzelmessungen eine höhere Messgeschwindigkeit als das konfokale Mikroskop. Dennoch sind auch Durchflusszytometer bei der Datengenerierung in ihrer Geschwindigkeit begrenzt. Eine FACS-Analyse mit Proben, die jeweils mit verschiedenen Fluorophoren angeregt sind, kann mehrere Stunden beanspruchen. Das wiederum führt zu einer möglichen Abweichung der Messergebnisse, da sich bei längeren Messzeiten Zellprozesse verändern können oder die anfänglich sichtbare Aktivierung nicht mehr messbar ist.

Mikroplatten-Reader verbessern Messzeiten zellbasierter Assays

Die Entdeckung des GFP führte letztlich auch zu einem vermehrten Einsatz von Mikroplatten-Readern in Life-Science-Laboren. Während bisherige Mikroplatten-Reader hauptsächlich zur Untersuchung von einfachen, homogenen Absorptions-, Lumineszenz- und Fluoreszenz-basierten Laborversuchen eingesetzt wurden, entwickelten Hersteller leistungsfähige Multifunktions-Mikroplatten-Reader für die besonderen Ansprüche des High-Throughput-Screening. Die Reader sind in der Lage komplexe, heterogene, zellbasierte Assays in Mikroplatten mit 6 bis hin zu 3456 Wells zu messen. Durch die Messung von mL- bis zu nL-Volumina können zellbasierte Assays in nur wenigen Minuten reproduzierbar gemessen werden.

Messung von unten bleibt Herausforderung

Bis vor kurzem bestand jedoch auch bei der Verwendung von Mikroplatten-Readern ein Nachteil. Für die Beobachtung zellbasierter Assays in Echtzeit wird die Messung von der Unterseite der Mikroplatten bevorzugt. Durch die Messung von unten kann die Mikroplatte oben mit einer Abdeckung verschlossen werden. Dies wiederum verhindert eine Kontamination der Zellen und die Verdampfung von Flüssigkeiten während des Laborversuches. Generell ist das Signal bei Messungen von oben (ohne Abdeckung) jedoch höher als bei der Messung von unten. Das ist zum einen darauf zurück zu führen, dass das Plastik am Grund der Mikroplatte einen Teil des Anregungs- und Emissionslichtes absorbiert und so ein geringeres Gesamtsignal zu Stande kommt. Zum anderen nutzen Mikroplatten-Reader lange Lichtleiter um das Anregungslicht bis zur Unterseite der Mikroplatte zu leiten. Auf diese Weise geht ein weiterer Anteil des Anregungs- und Emissionslichtes verloren, was wiederum zu einem schwächeren Gesamtsignal führt.

Neues Messverfahren ohne Lichtleiter schafft Abhilfe

Der deutsche Hersteller für Mikroplatten-Reader BMG Labtech in Ortenberg, Baden-Württemberg hat die Nachfrage nach Geschwindigkeit und einer hohen Signalstärke erkannt und zur Verbesserung der zellbasierten Assays ein neues Verfahren für die Messung von unten entwickelt. Die Lösung ist die Nutzung des direkten, optischen Weges, auf dem das Anregungs- und Emissionslicht ohne signifikanten Lichtverlust zum Boden der Mikroplatte geleitet wird.

Das System ist vergleichbar mit dem eines Mikroskops. Die Software steuert eine Reihe motorisch angetriebener Spiegel, die das Licht auf direktem Weg entweder bis zur Ober- oder Unterseite der Mikroplatte leiten. Dies ermöglicht auch den einfachen Wechsel zwischen der Messung von oben und der Messung von unten. Die beiden BMG Labtech Mikroplatten-Reader Pherastar FS und Clariostar erfordern dazu keine Installation zusätzlicher Hardware, wie Optik-Module, Filter oder dichroitische Spiegel. Das System ist in den leistungsstarken Geräten vollständig integriert und nutzt keine Lichtleiter, sodass das Licht auf direktem Weg auf den Wellboden trifft.

Der Vorteil dieser Methode wird in Abbildung 3 deutlich. Bei der direkten Messung von unten werden etwa doppelt so hohe Signal/Blank-Werte erreicht wie bei einem Gerät, das Lichtleiter für die Messung verwendet. Daraus ergibt sich ein größerer Dynamik-Bereich für das Assay und eine höhere Sensitivität.

* Dr. F. Maurer: BMG LABTECH GmbH, 77799 Ortenberg

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