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Mikro-LC Evaluierung eines Säulenschaltkonzepts für die Mikro-LC-MS

Autor / Redakteur: Thorsten Teutenberg, Terence Hetzel, Steffen Wiese* / Dr. Ilka Ottleben

Die Mikro-LC zeichnet sich u.a. durch ultra-schnelle Analysenzeiten und geringen Lösemittelverbrauch aus. Sollen im Rahmen der Routineanalytik mittels eines Säulenschaltventils mehrere Säulen automatisiert ansteuern werden, gilt es einiges zu beachten.

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Abbildung 1a: Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus inklusive der Ventilschaltung. Nach der Trennsäule wird zwischen Variante A (1/32") und Variante B (360 µm OD) differenziert.
Abbildung 1a: Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus inklusive der Ventilschaltung. Nach der Trennsäule wird zwischen Variante A (1/32") und Variante B (360 µm OD) differenziert.
(Bild: Institut für Energie und Umweltechnik e.V.)

Nach einer langen „Durststrecke“ halten mikroanalytische Trenntechniken nun doch vermehrt Einzug in Routinelaboratorien. Die Vorteile der Mikro-LC wie ultra-schnelle Analysenzeiten, geringer Lösemittelverbrauch und hohe Energieeffizienz, liegen klar auf der Hand.

Dabei möchte der Anwender jedoch nicht auf bestimmte Merkmale verzichten, die zum Stand der Technik für konventionelle UHPLC-Systeme gehören. Hierzu zählt u.a. ein Säulenschaltventil, mit dem mehrere Säulen automatisiert angesteuert werden können.

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Säulenschaltventile in der Routineanalytik

Vor dem Kontext der automatisierten Methodenentwicklung sind Säulenschaltventile äußerst nützlich, um über Nacht verschiedene Säulen mit unterschiedlicher Selektivität zu evaluieren. Im Optimalfall liegt bereits am nächsten Tag ein Datensatz vor, anhand dessen die optimale Säule für weitere Experimente ausgewählt werden kann. Säulenschaltventile sind jedoch auch in der Routineanalytik beliebt, da ihr Einsatz eine Optimierung der Geräteauslastung ermöglicht. Die meisten Laboratorien verfügen heute über eine Vielzahl an Methoden, für die nicht immer ein eigenes HPLC-System zur Verfügung steht.

Insbesondere bei der Kopplung mit massenspektrometrischen Detektoren muss die Auslastung hoch sein, da diese Geräte in der Anschaffung und dem Unterhalt sehr teuer sind. Mithilfe eines Säulenschaltventils lassen sich deshalb unterschiedliche Säulen auswählen, sodass auch bei sehr langen Probenserien, die z.B. über Nacht oder über das Wochenende gemessen werden, immer die für die jeweilige Methode beste Säule genutzt werden kann.

Während die bei klassischen HPLC-Systemen auftretenden Totvolumina häufig als unkritisch anzusehen sind, muss bei zunehmender Miniaturisierung der Säulendimension jegliches Totvolumen minimiert werden. Vor diesem Hintergrund können klassische Säulenschaltventile in Kombination mit Mikro-LC-Säulen nicht verwendet werden, da sonst die auf der Säule erzielte Trennung komplett zunichte gemacht würde.

Miniaturisierte Trennung fordert Ventiltechnik heraus

Damit die oben beschriebenen Konzepte Einzug in den Bereich der miniaturisierten Trenntechniken erhalten, ist eine Weiterentwicklung im Bereich der Ventiltechnik notwendig. Dabei steht vor allem die Minimierung sämtlicher Totvolumina im Vordergrund. Die Firma Vici bietet so genannte Nanovolume-Selectorventile an, die sich durch besonders geringe Anschlussvolumina von wenigen Nanolitern auszeichnen und den Anschluss von vier bis zehn Trennsäulen ermöglichen. Dabei umfasst dieses Volumen sowohl das Durchgangsvolumen des Stators als auch der Gravur des Rotors, im Folgenden als „Port-to-Port“-Volumen bezeichnet. Generell werden zwei Arten (Variante A/Variante B) von Selectorventilen angeboten, die sich sowohl in der Anschlusstechnik als auch dem spezifizierten Totvolumen unterscheiden. Variante A verfügt über 1/32"-Anschlüsse mit einem „Port-to-Port“-Volumen von 28 nL, die den Einsatz von 1/32“-Peeksil-Kapillaren erlauben. Diese Kapillaren werden mittlerweile mit Innendurchmessern von bis zu 25 µm und einer Länge ab 5 cm kommerziell angeboten.

Variante B hingegen ist auf Fused-Silica-Kapillaren mit einem Außendurchmesser (OD) von 360 µm ausgelegt und weist ein Volumen von lediglich 18 nL auf. Durch die Verwendung von Fused-Sillica-Kapillaren ist dem Anwender die Möglichkeit gegeben, Längenanpassungen der Kapillaren selbst durchzuführen. Dies kann mittels eines Diamantblatt-Kapillarschneiders erfolgen und erlaubt die flexible Anordnung aller Bauteile, sodass das Totvolumen reduziert wird. Allerdings muss auf der Seite der Trennsäule eine Aufweitung des Kapillaraußendurchmessers mittels eines Sleeves erfolgen, damit die Kapillare an die Säule angeschlossen werden kann.

Auch wenn die „Port-to-Port“-Volumina der unterschiedlichen Ventile lediglich 28 bzw. 18 nL betragen, so muss der Einfluss des verbleibenden Totvolumens auf die Trennleistung untersucht werden. Zu diesem Zweck wurden Analysen mittels UV-Detektion sowohl mit als auch ohne Ventilschaltung durchgeführt. Der Bereich nach der Trennsäule ist als besonders kritisch zu bewerten, da die Elutionsbande nach Verlassen der Trennsäule nicht mehr komprimiert werden kann. Vor diesem Hintergrund wird an dieser Stelle sowohl die Ventilvariante A als auch die volumenärmere Variante B eingesetzt, um den Einfluss der Differenz von lediglich 10 nL des „Port-to-Port"-Volumens zu bewerten. Abbildung 1 a zeigt den für die Ventilschaltung gewählten Versuchsaufbau.

Um den Einfluss der Ventile auf die chromatografische Trennleistung bewerten zu können, wurden die Experimente ohne Schaltventile wiederholt. Dabei wurden die restlichen Systemvolumina konstant gehalten. Abbildung 1 b zeigt den Aufbau ohne den Einsatz jeglicher Schaltventile. Die Volumina aller Verbindungskapillaren können Tabelle 1 entnommen werden. Bei den Analyten handelt es sich um ein Testgemisch, das im Bereich der Trennsäulen- und Gerätecharakterisierung Verwendung findet. Der Laboraufbau ist in Abbildung 2 dargestellt. Als Trennsäule diente eine Eksigent Halo C18–Phase (50 mm x 0,5 mm, 2,6 µm). Zur statistischen Absicherung wurde jede Analyse fünffach durchgeführt.

Abbildung 3 zeigt ein Overlaychromatogramm des Testgemisches mit den unterschiedlichen Systemaufbauten. Die Analyse wurde in allen Fällen bei einer Flussrate von 50 µL min-1 durchgeführt. Bei oberflächlicher Betrachtung der Chromatogramme a)-c) fällt zunächst kein signifikanter Unterschied in Bezug auf die Peakbreiten auf. Bei genauer Analyse der Retentionszeiten für die Komponenten 7 und 9 wird ersichtlich, dass die Nutzung von zwei 1/32"-Ventilen (s. Abb. 3 c) zu keinen signifikanten Unterschieden im Vergleich zur Analyse ohne Schaltventile (s. Abb. 3 a) führt. Im Gegensatz dazu ist ein leichter Versatz zu höheren Retentionszeiten zu beobachten, wenn der Aufbau mit einem 1/32" vor und einem 360-µm-OD-Ventil statt einem 1/32“ nach der Trennsäule verwendet wird (s. Abb. 3 b im Vergleich zu Abb. 3 c). Dies erscheint zunächst wenig plausibel, da das Gesamtsystemvolumen in Anwendung b) kleiner ist als in der Anwendung c). Allerdings spielt hier die Anschlusstechnik eine entscheidende Rolle. Eine totvolumenarme Verbindung mit einem 360-µm-Ventil herzustellen, ist wesentlich anspruchsvoller, da die Schraubengröße lediglich 3 mm beträgt. An dieser Stelle ist etwas mehr Geschick und Übung notwendig. Nichtsdestotrotz kann mithilfe so genannter Extender-Tools eine Verbesserung der Verbindungsqualität in Bezug auf das Totvolumen erreicht werden. Des Weiteren kann die Ursache der Retentionszeitverschiebung durch die selbstgeschnittenen Fused-Silica-Kapillaren erklärt werden. Beim Zurechtschneiden dieser Kapillaren kann es aufgrund von Ungenauigkeiten sowohl beim Abmessen als auch dem eigentlichen Schneidvorgang zu ungewollten Abweichungen des Kapillarvolumens kommen.

Die Betrachtung der Peakweiten zeigt ebenfalls eindeutig, dass alle ermittelten Werte vergleichbar sind (Daten nicht angegeben). Die relativen Standardabweichungen betragen für alle Anwendungen maximal 1,5 %. Dies untermauert den robusten Einsatz der Schaltventile und die sehr gute Reproduzierbarkeit, die mit dem Mikro-LC-System erzielt wird.

Mikro-LC – Säulenschaltventile erfolgreich eingebunden

Zusammenfassend ist festzuhalten, dass kein signifikanter Einfluss der zusätzlichen Volumina der Ventile auf die resultierende Chromatografie zu beobachten ist. Die Differenz zwischen Variante A und B von 10 nL ist bei einem Säuleninnendurchmesser von 500 µm vernachlässigbar. In Bezug auf die Konnektierung der Ventile mit den Kapillaren ist anzumerken, dass der Umgang mit der Ventilvariante A einfacher ist. Generell sind für diesen Bereich mittlerweile sehr robuste und hochdruckstabile 1/32“-Fittings bzw. Fingertights verfügbar, sodass nahezu jeder Anwender in der Lage ist, qualitativ hochwertige Verbindungen herzustellen. Mit etwas Routine in der Herstellung der Verbindungen zwischen den einzelnen Systemkomponenten ist die Ventilvariante B ebenfalls eine sehr gute Alternative.

Alles in allem zeigen die Ergebnisse die erfolgreiche Einbindung von Säulenschaltventilen im Bereich der Mikro-LC. Die geforderte Flexibilität für den Routinebetrieb ist gegeben, wodurch dem Einsatz auch in Kombination mit der Massenspektrometrie nichts im Wege steht.

An dieser Stelle möchten wir uns bei Dr. Hagen Preik-Steinhoff der Firma Vici für die freundliche Überlassung der Nano-Selectorventile sehr herzlich bedanken.

* Dr. T. Teutenberg, T. Hetzel, Dr. S. Wiese: Institut für Energie- und Umwelttechnik e. V., 47229 Duisburg

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