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Extractables und Leachables Extractables und Leachables – Pharmaverpackungen richtig analysieren

Autor / Redakteur: Michael Jahn* und Armin Hauk* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Aus Gründen der Patientensicherheit müssen Pharmaverpackungen auf Extractables und Leachables getestet werden. Neben den eingesetzten analytischen Methoden ist auch deren Abfolge im Test für aussagekräftige Ergebnisse entscheidend.

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Pharmahersteller sind dazu verpflichtet, umfangreiche Studien zu Extractables und Leachables (E&L) durchzuführen. Die Behörden wollen so sicherstellen, dass keine schädlichen Stoffe aus der Pharmaprimärverpackung in die pharmazeutische Formulierung gelangen. Dies soll vor allem dem Schutz von Patienten dienen. In der Vergangenheit zeigte sich, dass Patienten durchaus mit schädlichen Stoffen belastet wurden, z.B. mit N-Nitrosaminen und polycyclischen Kohlenwasserstoffen aus Gummidichtungen in Inhalationssystemen.

Eine E&L-Studie wird in vier Schritten durchgeführt: Erster Schritt ist eine kritische Überprüfung des Verpackungssystems und möglicher Interaktionen mit der pharmazeutischen Formulierung, sowie eine Evaluierung der momentanen behördlichen Richtlinien. Im zweiten Schritt – der Extractables-Studie – wird das Verpackungsmaterial unter verschärften Bedingungen (erhöhte Temperatur, höhere Lösungsmittelstärke als die pharmazeutische Formulierung) extrahiert, und die Extrakte werden instrumentalanalytisch untersucht. Die systematische Anwendung eines analytischen Methodensatzes gewährleistet, dass alle potenziell migrierenden Stoffe qualitativ und quantitativ erfasst werden. Im dritten Schritt wird von Toxikologen evaluiert, welche der gefundenen Verbindungen als kritisch einzustufen sind. Im abschließenden vierten Schritt – der Leachables-Studie – werden diese Verbindungen dann in der pharmazeutischen Formulierung, die unter standardisierten Bedingungen in der Primärverpackung gelagert wurde, mit validierten analytischen Methoden (cGMP) quantifiziert.

Bisher gibt es keine behördlichen Anforderungen dafür, wie eine E&L-Studie methodisch durchgeführt werden muss. Dies kann allerdings bei unerfahrenen Anwendern zu Verunsicherungen führen. Durch die langjährige E&L-Erfahrungen bei Ciba Expert Services ist hier eine Expertise bei der laborseitigen Abwicklung von E&L-Studien und der Auswahl von analytischen Methoden entstanden.

Thermodesorption-GC/MS als Einstieg

Einen guten methodischen Einstieg in eine Extractables-Studie liefert eine Thermodesorption-GC/MS-Analyse (TDS-GC/MS, s. Abb. 2a) des polymeren Materials. Dieses wird direkt mittels eines inerten Trägergasstroms bei hohen Temperaturen thermisch „extrahiert“, und flüchtige Verbindungen werden mittels GC/MS analysiert. Eine detaillierte Analyse der teils komplexen Chromatogramme ist hilfreich bei der späteren Suche der Verbindungen in den Plastikextrakten, denn viele der thermodesorbierbaren Verbindungen sind gleichzeitig auch extrahierbar. In der Tat konnte in ethanolischen und wässrigen Extrakten des obigen Kathetermaterials Bisphenol A gezielt gesucht und gefunden werden. Die TDS-GC/MS-Analyse von Plastikextrakten gibt die Möglichkeit zur „Large-Volume-Injektion“, bei der ein großes Volumen des Extrakts in das GC/MS-System überführt wird, wodurch die geforderten niedrigen Nachweisgrenzen der Analyten erreicht werden.

Hochsiedende Säuren, Alkohole oder Amine entziehen sich der direkten GC/MS-Analyse. Durch Derivatisierung (z.B. Silylierung) entstehen die entsprechenden Silylester, -ether und -amine, die dann GC/MS-kompatibel sind. So werden beispielsweise Polysiloxane häufig mithilfe von Peroxiden, z.B. Bis-(dichlorbenzoyl)-peroxid, quervernetzt. Ein Abbauprodukt dieses Peroxids ist die Dichlorbenzoesäure, die sich aufgrund ihrer hohen Polarität nicht mittels GC/MS analysieren lässt. Erst nach Derivatisierung zum Trimethylsilylester konnte die Verbindung in den Extrakten eines Medizinalprodukts detektiert und quantifiziert werden. Erfahrung bei der Interpretation von Massenspektren für die Identifikation von derivatisierten Verbindungen ist hier hilfreich, denn oft finden sich Derivate nicht in MS-Spektrendatenbanken.

Headspace-GC/MS analysiert Druckfarbe

Die Headspace-GC/MS (HS-GC/MS) eignet sich für die Analyse von flüchtigen Extractables. Pharmaprimärverpackungen werden in der Regel zur Kennzeichnung des Herstellungs- sowie Ablaufdatums bedruckt. So können Verbindungen aus einer Farbformulierung durch die polymere Primärverpackung migrieren. Für die Analyse wurde das bedruckte Plastikmaterial (und als Kontrolle das unbedruckte) wässrig extrahiert, und mittels HS-GC/MS konnte in den Extrakten Cyclohexanon als eines der Farbmittelbestandteile identifiziert und auf einem ppm-Niveau (relativ zur Plastikmenge) quantifiziert werden (s. Abb. 3).

Thermoplastische Materialien stellen in der Regel keine Migrationsbarriere für niedermolekulare Verbindungen dar. Wenn die Primärverpackung zunächst mit Wasser befüllt und anschließend auf der Außenseite bedruckt wurde, konnte Cyclohexanon in der Wasserphase mittels HS-GC/MS gefunden werden.

LC/MS für schwerflüchtige und polare Substanzen

Flüssigchromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie (LC/MS) kann in Extractables-Studien für die Analyse von schwerflüchtigen und polaren Verbindungen eingesetzt werden. Die Chemikalie ADK STAB NA 11 (Struktur s. Abb. 4) wird als Nukleierungsmittel für Polypropylen (PP) eingesetzt. Bei der Extraktion mit wässrigen Puffern (unterschiedliche pH-Werte) einer polymeren Primärverpackung, die zum Teil aus PP bestand, wurde ADK STAB NA 11 mit LC/MS quantifiziert. Die Konzentration der Verbindung stieg mit dem pH-Wert der Extraktionslösungen: bei pH 3 fanden sich ungefähr 0,01 ppm, bei pH 10 etwa 3 ppm (relativ zur Menge an extrahiertem Verpackungsmaterial). Nachdem eine Komponente als eine „Extractable“ identifiziert ist, kann das LC/MS-Instrument im MS/MS-Modus optimiert werden. Dann lassen sich Verbindungen selbst in extrem niedrigen Konzentrationen (ppt-ppb-Bereich) quantifizieren. Der große Vorteil der LC/MS-Analyse liegt in der Möglichkeit, Extrakte direkt und ohne Probenvorbereitung zu analysieren. Speziell für Einsteiger ist es allerdings ein Nachteil, dass die Methode keine strukturellen Aussagen über die detektierten Verbindungen liefert. Hier lohnt sich der Aufbau eigener Datenbanken, wo das chromatographische und das massenspektrometrische Verhalten von typischen Plastikadditiven (und deren Abbauprodukten) als Referenzverbindungen mit den unbekannten Verbindungen im Extrakt abgeglichen wird.

Oft werden auch anorganische Additive und Pigmente polymeren Systemen hinzugefügt. Dies verlangt nach Methoden mit deren Hilfe Metalle spurenanalytisch quantifiziert werden können. Die eingesetzten Methoden sind hier ICP-AES oder ICP-MS. In einer Extractables-Studie bei Ciba Expert Services wurde ein Kupferphthalocyanin-Komplex detektiert, der als Pigment (C.I. Pigment Blue 15, Struktur s. Abb. 5) auf die Außenseite der Primärverpackung aufgebracht wurde. Da das Pigment Kupfer enthält wurde ICP-AES zur Quantifizierung der Verbindung in wässrigen Extrakten des bedruckten Verpackungsmaterials verwendet: Es konnte Kupfer in ppm-Konzentrationen gefunden werden. Erfahrung auf dem Gebiet der Polymer- und Pigmentchemie hilft bei der Durchführung von Extractables-Studien, da z.B. im Falle des Kupferphthalocyanin-Komplex die Struktur des Pigments unbekannt war und nur durch Einsatz spezieller Methoden (hochauflösende Direkteinlass-MS) und maßgeschneiderter MS-Datenbanken aufgeklärt werden konnte.

Um sicherzustellen, dass in einer Extractables-Studie alle extrahierbaren Verbindungen erfasst wurden, wird verglichen, ob sich die Konzentration der quantifizierten Verbindungen mit dem Gesamtkohlenstoffgehalt (TOC) des Extrakts korrelieren lässt. Die Korrelation sollte hoch sein (mehr als 70 Prozent); falls der TOC-Gehalt viel höher ist als die Summe aller quantifizierten Verbindungen wurden nicht alle Verbindungen erfasst. In einer durchgeführten Extractables-Studie konnte durch die zusätzliche Anwendung von IR- und 1H-NMR-Spektroskopie sowie MALDI-TOF-MS-Experimenten gezeigt werden, dass der ungewöhnlich hohe TOC-Gehalt in wässrigen Plastikextrakten (über 100 ppm) durch Polyethylenglykol-Oligomere verursacht wurde, die sich durch Standardmethoden nicht nachweisen ließen.

Analytische Methodik für Leachables-Studien

Leachables-Studien werden an Arzneimittelformulierungen – normalerweise aus Stabilitätsstudien – unter cGMP durchgeführt. Die validierten analytischen Methoden für Leachables-Studien unterliegen bestimmten Kriterien: Sie müssen einerseits sehr spezifisch sein, um die Analyten in komplexen Arzneimittelformulierungen zu quantifizieren, andererseits müssen sie empfindlich sein, um für kritische Verbindungen sehr niedrige Nachweisgrenzen zu garantieren (s. PQRI-Empfehlungen für inhalierbare Formulierungen: Tagesdosis unter 0,15 μg, teils unter 1 ng).

Für Extractables-Studien kann dem Anwender ein fester Satz analytischer Methoden an die Hand gegeben werden. Dies ist für Leachables-Studien nicht möglich, da hier von Fall zu Fall spezifische Methoden entwickelt werden müssen. Ein Beispiel: Es wurden Methoden für die Probennahme und Analyse von zwölf N-Nitrosaminen als potenzielle Leachables aus einem Inhalationssystem entwickelt und validiert. Die Aluminiumprobengefäße (Stabilitätsproben analog ICH-Richtlinien) wurden auf -70°C gekühlt und aufgebohrt. Der Inhalt wurde in ein gekühltes Glasgefäß überführt, und das Inhalationssystem wurde mit Ethanol nachgewaschen. Nach Zusatz eines Antioxidanz wurde das Lösungsmittel verdampft und die ethanolische Lösung aufgearbeitet. Es wurden zwei GC/MS-Methoden (EI- und CI-Ionisation) entwickelt, um alle zwölf Nitrosamine detektieren zu können. Das Methodenset wurde dann nach ICH Q2A/Q2B Richtlinien validiert, wobei Spezifität, Selektivität, Linearität, Präzision, Reproduzierbarkeit, Robustheit, Nachweis- und Quantifizierungsgrenze evaluiert wurden. Dies zeigt die Individualität von Leachables-Studien. Selbst für eine Verbindungsklasse mussten zwei unterschiedliche analytische Methoden entwickelt werden, um den empfohlenen Grenzwert zu erreichen.

Fazit: Eine Vielzahl analytischer Methoden ist nötig

Zur erfolgreichen Durchführung von E&L-Studien muss eine Vielzahl von analytischen Geräten und Methoden eingesetzt werden. Extractables-Studien verlangen nach einer vollständigen qualitativen wie quantitativen Erfassung von Analyten mit unterschiedlichsten chemischen Strukturen und Eigenschaften. Zusätzlich zum analytischen Know-how sind Kenntnisse auf den Fachgebieten Polymer- und Additivchemie, sowie Farbmittel und Coatings unerlässlich. Nach einer Extractables-Studie sollte der Analytiker sicher sein, dass keine anderen als die detektierten Komponenten aus dem Verpackungsmaterial in die pharmazeutische Formulierung migrieren können. Danach müssen für die Leach-ables-Studie spezifische Methoden entwickelt und validiert werden, um diese Verbindungen in der Arzneimittelformulierung detektieren zu können. Hier ist neben dem analytischen Sachverstand auch ein etabliertes GMP-System gefragt.

Hintergrund: Begriffsdefinitionen

  • Extractables: Komponenten, die unter verschärften Bedingungen aus einer Pharmaprimärverpackung extrahiert werden und daher potenziell in das Pharmazeutikum migrieren können.
  • Leachables: Komponenten, die unter normalen Lagerbedingungen aus der Pharmaprimärverpackung in das Pharmazeutikum migrieren.

Analytisches Methodenset – Eingesetzte Techniken bei E&L-Studien

  • Verpackungsmaterial: Zur Anwendung kommt Thermodesorption gekoppelt mit Gaschromatographie und Massenspektrometrie (TDS-GC/MS).
  • Extrakte des Verpackungsmaterials: Eingesetzt werden (TDS-)-GC/MS, GC/MS von Derivaten, Flüssigchromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie, Atomemissionsspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-AES) sowie IR-Techniken zur Bestimmung des Gesamtkohlenstoffgehaltes (TOC).
  • Zusätzlich können Methoden zur Strukturaufklärung und Synthese nicht kommerzieller Referenzen eingesetzt werden.

*Dr. M. Jahn und Dr. A. Hauk, Ciba Expert Services, 4002 Basel/Schweiz

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