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Automatisierter Färbeautomat für Whole-Mounts und Gewebeschnitte Farbenspiel der Gene in der Mikroskopie hervorbringen

Autor / Redakteur: Dr. Martin Technau, Ulf Sengutta* / Christian Lüttmann

So unterschiedlich die Lebewesen auf der Erde sind, haben sie doch eines gemein: Ihr Bauplan ist in der DNA gespeichert. Um zu verstehen, wie die DNA in Organismen ausgelesen wird, eignen sich molekularbiologische Methoden, bei der Gensequenzen zielgerichtet eingefärbt werden. Das ist mit viel Arbeit verbuden... eigentlich.

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Abb.1: Ergebnisse von automatisierten ISH und IHC Protokollen an unterschiedlichen Organismen und Präparaten (Details in der Bildansicht in der Bildergalerie).
Abb.1: Ergebnisse von automatisierten ISH und IHC Protokollen an unterschiedlichen Organismen und Präparaten (Details in der Bildansicht in der Bildergalerie).
(Bild: s. Literatur)

Der genetische Code ist die Sprache des Lebens. In ihm sind die Merkmale hinterlegt, die einen Organismus ausmachen. Doch schon länger weiß man, dass es nicht nur darauf ankommt, welche Gene in der DNA verschlüsselt sind, sondern auch darauf, welche genetischen Informationen tatsächlich transkribiert, also ausgelesen, werden.

Dies lässt sich mit modernen Hochdurchsatzmethoden im Bereich der Genexpressionsanalyse analysieren, die eine genomweite Transkriptom-Analyse ermöglichen. Das bedeutet, dass alle vom Genom produzierten RNA-Transkripte untersucht werden.

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In den vergangenen Jahren und Jahrzenten haben in diesem Feld vor allem Microarray-Experimente (DNA-Chip-Technologien) sowie moderne sequenzbasierte Methoden wie die Gesamt-Transkriptom-Shotgun-Sequenzierung (RNA-Seq) zu einer Fülle von Daten über potenzielle Gene und deren Genprodukte geführt. Dabei müssen die Daten allerdings häufig validiert werden, etwa durch eine gesonderte Analyse der Expressionsmuster innerhalb des Gewebes oder in der Mikroumgebung des Zellverbandes. Erst mit derart überprüften DNA-Chip- oder RNA-Seq-Daten lassen sich beispielsweise den noch unbekannten Genen ihre Aufgaben im biochemischen Netzwerk der Zelle, des Gewebes oder des ganzen Organismus zuordnen.

Aufgrund der hohen Aussagekraft ist hier die Methode der In-situ-Hybridisierung (ISH) besonders geeignet, mit der Nukleinsäuresequenzen (RNA und DNA) direkt in Zellen und Geweben sichtbar gemacht werden können. Auch in anderen Bereichen, z.B. der Krebsdiagnostik, spielt der Nachweis über ISH eine besondere Rolle. Darüber hinaus lassen sich durch den Einsatz von Immunhistochemie-Protokollen (IHC) Proteine oder andere Strukturen mithilfe von markierten Antikörpern sichtbar machen.

Beide Techniken zählen zu den aussagekräftigsten Methoden, welche die moderne Molekularbiologie zu bieten hat. Drei besondere Vorteile dieser Ansätze sind:

  • die Möglichkeit, Genexpressionen auf beiden Ebenen in zeitlicher Abhängigkeit zu untersuchen,
  • der direkte Nachweis einer RNA oder eines Proteins am Ort der Entstehung oder Wirkung und
  • der direkte Erhalt publizierbarer Bilder.

Allerdings müssen diese Vorteile teuer bezahlt werden, da die Protokolle sehr arbeits- und zeitintensiv sind. Meist gilt es, über einen Zeitraum von mehreren Tagen regelmäßig Reagenzien auszutauschen. Eine kleine Unachtsamkeit, und schon ist das Experiment ruiniert.

Whole-Mounts und Dünnschnitte

Die Anwendung der ISH- und IHC-Methoden kann man prinzipiell in zwei verschiedene Gruppen aufteilen. Zum einen Whole-Mount-Präparate (Whole-Mounts) – also ganze Organismen, Organe und Vibratomschnitte (floating-sections) – die schwimmend prozessiert werden, und zum anderen dünne Gewebeschnitte (2-50 µm), die zur Stabilisierung des Gewebes auf Objektträger aufgebracht werden müssen.

Die Untersuchung von Whole-Mount-Präparaten liefert schöne Ergebnisse, wenn man Expressionsmuster in ganzen Organismen aufklären möchte. Sie wird daher beispielsweise in der Entwicklungsbiologie bei der Untersuchung entwicklungsspezifischer Gene eingesetzt (s. Abb. 1C und D).

Darüber hinaus haben schwimmende Vibratomschnitte von Organen (z.B. floating sections von Gehirnen) gegenüber Dünnschnitten einen Vorteil bei der dreidimensionalen Darstellung im konfokalen Mikroskop. Denn hier werden Artefakte vermieden, anders als bei der 3D-Rekonstuktion aus vielen einzelnen, dünneren Schnitten.

Alle Whole-Mount-Methoden stoßen im adulten tierischen Gewebe und bei der Arbeit mit Pflanzen aber auch an Grenzen, da Proben und Antikörper nur schwer in voll ausdifferenziertes Gewebe eindringen können. In diesen Bereichen findet die Färbung beinahe ausschließlich auf dünnen Gewebeschnitten statt.

Ein Vorteil dieser Technik ist ihr sehr gutes Auflösungsvermögen. Signale können bis auf die zelluläre Ebene nachgewiesen werden (s. Abb. 1H).

Bei beiden Techniken erfolgt die Detektion der Zielmoleküle prinzipiell nach dem gleichen Schema. Das Gewebe wird in einer Reihe von Schritten

  • rehydratisiert,
  • permeabilisiert (mithilfe von Proteinasen, Detergenzien oder Hitze),
  • prähybridisiert bzw. blockiert (zur Absättigung nichtspezifischer Bindungsstellen),
  • inkubiert (mit der spezifischen Probe oder dem spezifischen Antikörper),
  • mit Reagenzien behandelt, die die Detektion der Signale erlauben.

Zusammen mit allen nötigen Waschschritten kommt man so schnell auf Protokolle, die 30 bis 40 Pufferwechsel erfordern.

Ergänzendes zum Thema
In-situ-Hybridisierung

Jeder Mensch trägt zehntausende Gene in sich – doch längst nicht jedes Gen wird auch genutzt. Wird ein Gen vom Körper ausgelesen, z.B. bei der Proteinbiosynthese, so werden einsträngige Kopien dieses Abschnitts aus dem Zellkern freigegeben (mRNA). Mithilfe der In-situ-Hybridisierung lassen sich solche Kopien, und damit Genaktivitäten, sichtbar machen. Dabei setzt man DNA-Sonden ein, die genau an eine bestimmte mRNA passen. Diese Sonden sind mit einem Fluoreszenzmarker versehen und können daher in mikroskopischen Methoden leicht sichtbar gemacht werden. So erkennt man anhand der Fluoreszenz Bereiche, in denen ein bestimmtes Gen aktiv ist.

Höherer Durchsatz und bessere Reproduzierbarkeit

Um die geschilderten Vorteile der In-situ-Techniken voll auskosten zu können, ohne dabei die Nachteile der manuellen Prozessführung in Kauf nehmen zu müssen, bietet sich eine Automatisierung der gesamten Methode an. Dadurch wird eine präzise Kontrolle aller Inkubations-Parameter sowie eine optimale Reproduzierbarkeit erreicht.

Mit dem Insitu-Pro-Färbeautomat (s. Abb. 2) bietet CEM eine Komplettlösung für die vollautomatisierte In-situ-Hybridisierung und Immunhistochemie von Whole-Mounts/Totalpräparaten, Vibratomschnitten (Floating Sections), Dünnschnitten auf Objektträgern sowie adhärenten Zellen auf Deckgläschen an.

CEM führt damit die zuvor von der Firma Intavis vertriebene Insitu-Pro-Produktlinie fort, welche seit mehr als 20 Jahren von unterschiedlichen Forschungsgruppen weltweit eingesetzt wird und für die Prozessierung unterschiedlichster Gewebe und Modellorganismen getestet worden ist, u.a. Maus, Ratte, Zebrafisch, Huhn, Xenopus, Drosophila, Arabidopsis, Hydra, Medaka, Mollusken, Planarien und viele mehr (s. Abb. 1 und Referenzen online). Das Gerät ist in der Lage, bis zu 60 Präparate parallel und vollautomatisch zu bearbeiten, wobei jede Probe mit individuellen Sonden oder Antikörpern inkubiert werden kann. Durch die modulare Bauweise des Insitu-Pro ist es möglich, sowohl Whole-Mounts als auch Dünnschnitte auf einem Gerät zu prozessieren. Der Wechsel von Whole-Mounts auf Dünnschnitte erfolgt einfach durch den Austausch eines Arbeitsmoduls. Alle In-situ-Techniken an „schwimmendem“ Material werden in einzelnen, kleinen Körbchen durchgeführt (s. Abb. 4A, online). Diese können für jeden Schritt im frei wählbaren Temperaturbereich von 6 bis 75 °C inkubiert werden.

Die Bearbeitung von Dünnschnitten auf Glasobjektträgern erfolgt in separaten Inkubationskammern, die in eine temperierbare Wanne eingesetzt werden (s. Abb. 4B, online). Für beide Module gilt, dass sämtliche Schritte von der Rehydratisierung bis zum Anfärben des Materials vollautomatisch durchgeführt werden können. Ein System zum Flüssigkeitstransfer gestattet den Anwendern die Bearbeitung empfindlichster Organismen oder Gewebeschnitte.

Offenes System für freie Anpassung

Das Gerät benötigt zum Betrieb nur gewöhnliche Laborpuffer und ist offen konzipiert (kein Barcoding, keine Abhängigkeit von teuren Spezial-Kits). Außerdem können Proben und Antikörper in vielen Fällen wiederverwendet werden. Daher entstehen nur sehr geringe laufende Kosten. Wenn gewünscht, können jedoch auch beliebige Kits anderer Hersteller problemlos verwendet werden (TSA kit, RNAscope).

Eine Reihe vorinstallierter Standard-Protokolle erleichtert den direkten Einstieg. Mit der Geräte-Software lassen sich aber auch individuelle Anwender-Protokolle einfach anpassen. In einem Lauf können ggf. unterschiedliche Präparate individuell behandelt werden (z.B. unterschiedliche Proteinase-Verdau-Bedingungen).

Durch die große Arbeitsfläche mit Platz für bis zu 19 verschiedene Puffer und Lösungen plus 60 verschiedene Sonden oder Antikörper (s. Abb. 3), lassen sich auch komplexe Protokolle automatisieren. Trotzdem ist das Gerät kompakt dimensioniert und passt auf jeden Standard-Labortisch. Durch die Automatisierung ist es möglich, Experimente auch über Nacht und über das Wochenende weiter laufen zu lassen, ohne selbst eingreifen zu müssen. Außerdem wird das Risiko von Kontaminationen oder Pipettierfehlern vermieden.

Aufgrund der hohen Flexibilität kann der Automat vielseitig eingesetzt werden – er eignet sich sowohl als Routine-System für eine geringe Anzahl von Präparaten als auch für Hochdurchsatz-Screening-Experimente.

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