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HPLC-Trennsäulen Farbstoffe mit monolithischen Silicatrennsäulen nachweisen

Autor / Redakteur: Stephan Altmaier* / Dr. Ilka Ottleben

Anders als partikelgepackte Säulen eignen sich monolithische HPLC-Trennsäulen aus einem einzelnen, porösen Stab aus Silica sehr gut für die Analyse matrixhaltiger Proben. Der Anwender profitiert dabei zusätzlich von einer stark vereinfachten Probenvorbereitung.

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Abb. 1: Rasterelektroenmikroskopische Aufnahme der Struktur von Chromolith. Gut sichtbar sind in grau das mesoporöse Silicaskelett und makroporöse Transportporen.
Abb. 1: Rasterelektroenmikroskopische Aufnahme der Struktur von Chromolith. Gut sichtbar sind in grau das mesoporöse Silicaskelett und makroporöse Transportporen.
(Bild: Merck)

Schon im 19. Jahrhundert wurden Chemikalien zur Färbung von Lebensmitteln wie Käse oder Wein verwendet, hierbei handelte es sich fast durchweg um gesundheitlich bedenkliche Substanzen wie Bleioxid, Kupfersalze, Quecksilbersulfid oder Fuchsin. Die Entdeckung synthetischer Farbstoffe zu Ende des Jahrhunderts erlaubte schließlich Färbungen, die brillanter waren als die mit natürlichen Substanzen anorganischen oder organischen Ursprungs, dennoch waren viele dieser Verbindungen, darunter die Gruppe der Azofarbstoffe, beispielsweise nicht weniger giftig als die bald verbotenen Schwermetallsalze.

Mittlerweile wurden eine Vielzahl dieser alten, synthetischen Farbstoffe aus dem Verkehr gezogen, und heute sind in der EU noch etwa 45 Substanzen für die Färbung von Lebensmitteln zugelassen. Bei sechs dieser Verbindungen handelt es sich um Metalle oder Metallsalze wie Eisenoxid, Gold oder Calciumcarbonat, und 23 sind natürlichen Ursprungs (z.B. Anthocyane aus Brombeeren, Carotinoide aus Tomaten, Betanin aus Rüben) oder basieren auf natürlichen Verbindungen (z.B. Chlorophyllin aus Algen; Karamell). Alle übrigen Substanzen sind synthetisch und gehören in der Hauptsache zur Gruppe der Azofarbstoffe (s. Tab. 1). Praktisch jeder künstlich erzielte Farbton lässt sich heutzutage durch den Einsatz natürlicher Verbindungen erreichen, dennoch werden industriell erzeugte Farbstoffe immer noch in vielen Lebensmitteln eingesetzt, sei es aus wirtschaftlichen Gründen, sei es wegen ihrer häufig brillanteren Farben, die die Attraktivität vor allem von Süßigkeiten oder Getränken erhöhen. Da eine Großzahl von Farbstoffen [Tartrazin (E102), Chinolingelb (E104), Gelborange S (E110), Azorubin (E122), Cochenillerot (E124), Allurarot AC (E129), s. Tab. 2, online] im Verdacht stehen, z.B. die Hyperaktivität von Kindern negativ zu beeinflussen oder Allergien auszulösen, müssen in der EU mittlerweile alle betroffenen Lebensmittel entsprechend gekennzeichnet sein (Kennzeichnung lt. Verordnung (EG) Nr. 1333/2008 des Europäischen Parlaments und des Rates über Lebensmittelzusatzstoffe: „Kann Aktivität und Aufmerksamkeit bei Kindern beeinträchtigen.“).

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Die „Suche“ nach Proben

Die gute Nachricht, zumindest für Deutschland, ist, dass die Verwendung künstlicher Farbstoffe aufgrund kritischer Konsumenten stark rückläufig ist. Bei einem Streifzug durch deutsche Supermärkte kann man leicht selbst feststellen, dass sich die Suche nach entsprechenden Proben schwierig gestaltet und eigentlich nur noch bei wenigen Süßigkeiten oder alkoholischen Mischgetränken von Erfolg gekrönt ist. Viele der analysierten Proben stammen daher aus Supermärkten, die ausländische Produkte anbieten, Abbildung 3 zeigt beispielsweise die LC-MS-Analysenergebnisse eines farbstoffhaltigen Orangensaftes, der aus einem Asiashop stammt. In einem spanischen Supermarkt wurde ein aromatisierter und gefärbter Joghurt entdeckt, der ausschlaggebend für die Analyse eines farbstoffgespikten Naturjoghurts war (s. Abb. 3, unten).

Die im Rahmen dieser Arbeit analysierten Lebensmittel waren zwei Getränke sowie zwei feste Nahrungsproben, in denen künstliche Lebensmittelfarbstoffe per HPLC (High Performance Liquid Chromatography)-MS (Massenspektrometrie)-Kopplung nachgewiesen wurden. Vor allen Analysen wurde eine möglichst einfache und schnelle Probenvorbereitung durchgeführt, die Zielmoleküle mittels kurzer HPLC-Gradientenläufe von der komplexen Matrix getrennt und per MS-Detektion nachgewiesen.

HPLC-Untersuchungen: Materialien und Methoden

Als HPLC-System kam ein Dionex Ultimate 3000 (Thermo Scientific Dionex Corporation, Sunnyvale, Kalifornien, USA) mit monolithischer Chromolith Fast Gradient RP-18 endcapped 50-2 mm Trennsäule und Chromolith RP-18 endcapped 5-2 mm Guardsäule (beide Merck Millipore, Merck KGaA, Darmstadt) zur Anwendung. Ein Bruker-Esquire-6000-Massenspektrometer (Bruker Daltonik, Bremen) mit Ionenfalle und on-line-Elektrosprayionisationsquelle (ESI) wurde im negativen Modus und im m/z-Bereich von 100-850 (abhängig vom Analyten) genutzt.

Die Vorbereitung der Lebensmittelproben wurde wie folgt durchgeführt:

  • Lebensmittelfarbstoffe: Einige der untersuchten Proben wurden gespiked, hierzu wurden wässrige Einzelsubstanz-Stammlösungen der Farbstoffe mit folgenden Konzentrationen hergestellt: Tartrazin 166,4 mg/L, Chinolingelb 79,3 mg/L, Gelborange S 314 mg/L , Azorubin I 138 mg/L, Azorubin II 346 mg/L Cochenillerot A 1289 mg/L.
  • Rum-Wassermelone-Alkopopgetränk: Bei diesem alkoholischen Mischgetränk handelt es sich um eine wässrige Mischung von Rum und Zusätzen wie Zucker, Säureregulatoren, Konservierungsstoffen, Aroma und den zwei künstlichen roten Farbstoffen Amaranth (E123) und Allurarot AC. Der einzige Probenvorbereitungsschritt bestand in einer Filtration mit einen Spritzenvorsatzfilter mit 0,45 µm Porendurchmesser (Merck Millipore).
  • Orangensaft: Der Orangensaft besteht aus Saftkonzentrat, Zucker, Fruchtfleisch, Säuerungs- und Konservierungsmitteln, zwei Süßstoffen, Aroma und den künstlichen Farbstoffen Tartrazin, Gelborange S und Azorubin. Die Probe wurde durch einen Spritzenvorsatzfilter mit 0,45 µm Porendurchmesser filtriert. Für das Spiken des Orangensaftes wurden gleiche Volumina des Saftes und der Farbstoffstammlösungen von Tartrazin, Gelborange S und Azorubin I gemischt.
  • Kichererbsen: Diese Probe bestand ursprünglich aus Kichererbsen, die mit Zucker in vier verschiedenen Färbungen ummantelt waren. Aus der Mischung wurden für die Analyse 10 g Kichererbsen gesammelt, deren Zuckermantel mit Tartrazin orange eingefärbt war. Nach dem Zerkleinern mit Mörser und Pistill wurden lösliche Komponenten in 20 mL Wasser aufgenommen und in zwei Schritten per Faltenfilter und 0,45-µm-Spritzenvorsatzfilter filtriert. Das Spiken der Probe erfolgte durch Mischung des wässrigen Extrakts mit Tartrazin- und Chinolingelb-Stammlösung im Volumenverhältnis 2:7:1.
  • Joghurt: 10 mL eines Naturjoghurts wurden mit 30 mL ACN versetzt und 30 min gerührt, dann wurde für 20 min bei 4500 rpm zentrifugiert und die überstehende Lösung abdekantiert. ACN wurde dann während 90 min bei 40 °C und einem Druckluftstrom von 1 bar entfernt. Der Rückstand wurde abschließend durch einen Spritzenvorsatzfilter (0,45 µm) filtriert und mit den Stammlösungen von Cochenillerot A und Azorubin II im Volumenverhältnis 10:2:3 gemischt.

HPLC-Untersuchungen: Ergebnisse und Diskussion

Der erste Kandidat für eine chromatographische Untersuchung war ein alkoholisches Getränk auf Basis von Rum, versehen mit der Etikettaufschrift „Wassermelone“. Um dem vom Konsumenten erwarteten optischen Eindruck zu entsprechen, wurden zur Färbung der Mischung zwei rote Azofarbstoffe (Allurarot und Amaranth) eingesetzt. Zusammen mit dem künstlichen Melonenaroma ergibt sich ein stimmiges Bild. Abbildung 2 (oben) zeigt die chromatographische Trennung des Getränks in drei Hauptkomponenten innerhalb von nur knapp dreieinhalb Minuten. Eindeutig identifiziert werden konnte neben den beiden Farbstoffen auch Zucker, der als intensiver Peak zur Totzeit eluiert. Die in geringen Mengen zugesetzten Komponenten Sorbat, Citrat, Benzoat und der Aromastoff wurden nicht identifiziert.

Wie hoch die Robustheit der verwendeten Säule in der skizzierten Fragestellung war, konnte ein anschließender Langzeittest zeigen. Dieser Test zeigte, dass auch nach über 8000 Injektionen eine stabile Trennung entsprechend Abbildung 2 (oben) möglich war (Daten nicht dargestellt).

Der im Rahmen dieser Arbeit untersuchte Orangensaft stellt ein recht merkwürdiges Lebensmittel dar. Anscheinend waren die Produzenten des Getränkes sich ihrer Sache nicht sicher, weswegen der Natur auf die Sprünge geholfen wurde: Neben den drei künstlichen Farbstoffen Azorubin, Gelborange S und Tartrazin wurden dem Saft sowohl Süßstoffe (Acesulfam K und Aspartam) als auch Konservierungsmittel (Ascorbinsäure, Citronensäure, Natriumcitrat) zugesetzt. Wie vom Hersteller auf der Verpackung stolz vermerkt wird, enthält das Getränk absurderweise jedoch zusätzlich auch Orangenfruchtfleisch. Der Saft wurde vor der Analyse filtriert und mit den Farbstoffen Azorubin, Gelborange S und Tartrazin gespiked; ein einfacher Gradientenlauf erlaubte anschließend die Identifizierung der scharfen Farbstoffpeaks im stark matrixhaltigen Getränk (s. Abb. 2, unten). Zur Totzeit eluieren im Matrixpeak Zucker sowie die im Saft enthaltenen Konservierungs- und Süßstoffe.

Die untersuchten Kichererbsen wirkten als Probe zunächst recht unspektakulär, erwiesen sich aber im Verlauf der Probenvorbereitungsprozedur als etwas widerspenstig: Aufgrund des hohen Feststoffanteils durchlief die zähe Mischung vor der Injektion zwei Filtrationsprozesse. Die chromatographische Auftrennung wurde auf einer mit einer Guardsäule geschützten analytischen Säule durchgeführt und ist unkompliziert; mit einem bei reinem Wasser startenden Gradienten lässt sich Zucker als hydrophiler Hauptbestandteil der Matrix sehr gut von den künstlichen Farbstoffen trennen, die etwas verzögert und mit scharfen Peaks eluieren. Neben den zugesetzten Substanzen Tartrazin und Chinolingelb wurde bei etwa drei Minuten Gelborange S detektiert, welches als Verunreinigung aus der Zuckerkruste gelber Kichererbsen stammt. Die leichte Schulter des Signals für Chinolingelb resultiert aus dem Vorhandensein von zwei unterschiedlich substituierten Mononatriumisomeren des Farbstoffs in der Probe. Einige weitere Peaks im Bereich von zwei bis fünf Minuten wurden nicht zugeordnet, sie rühren vermutlich von Komponenten der Kichererbse selbst her.

Auch Milchprodukte sind vom Zusatz künstlicher Hilfsstoffe betroffen. So wird durch die Zugabe von Aromen und passenden künstlichen Lebensmittelfarben aus einem schlichten Naturjoghurt schnell ein Fruchtjoghurt. Auch wenn er so natürlich nicht deklariert werden darf, ist die optische und olfaktorische Täuschung recht simpel und erfolgversprechend. In Abbildung 3 (unten) ist die Analyse eines mit zwei roten Lebensmittelfarbstoffen gespikten Naturjoghurts dargestellt. Neben den beiden klar isolierten Peaks für die Farbstoffe traten eine Reihe weiterer, aus der Matrix stammende Signale auf, die nicht zugeordnet wurden.

* Dr. S. Altmaier: Merck Millipore, Merck KGaA, 64293 Darmstadt

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