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Fettsäuren Fettsäuren vollautomatisiert derivatisieren und bestimmen

| Autor / Redakteur: Guido Deußing* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Fettsäuren lassen sich gaschromatographisch nicht direkt untersuchen. Die notwendige Probenvorbereitung kostet viel Zeit und beinhaltet zahlreiche Fehlerquellen. Eine Automatisierierung der Probenvorbereitung, einschließlich Standardaddition und Derivatisierung, bis hin zur diskriminierungsfreien Injektion in das GC, bringt neben der Zeitersparnis auch einen deutlichen Sicherheitsgewinn mit sich.

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Je komplexer die Analytik, desto höher die Anforderungen, die ein Laborroboter erfüllen muss. Einen idealen Freiheitsgrad haben solche Geräte, die die Funktion von zwei Robotern für das Handling flüssiger Proben in sich vereinen. Wie etwa die Gerstel-MPS-Prepstation (s. Abb. 1), die von John Colwell, Bespak Europe, sowie Ray Perkins, Keith Summerhill und Jonathan Angove von Anatune in England zur Analyse von Fettsäuren eingesetzt wird.

Direkte Chromatographie von Fettsäuren ist nicht möglich

Tierische und pflanzliche Fette spielen als Bestandteil unserer Ernährung sowie als Schmier- und Gleitmittel eine wichtige Rolle. Ihre Analytik hat die Aufgabe, nicht nur den Reinheitsgrad von Fett und Öl zu untersuchen, sondern auch zu Deklarationszwecken den Fettgehalt und die -zusammensetzung in Lebensmitteln zu bestimmen. Fette und fette Öle sind Ester des dreiwertigen Alkohols Glycerin (Propan-1,2,3-triol) mit drei, meist verschiedenen, überwiegend geradzahligen und unverzweigten aliphatischen Monocarbonsäuren. Sie werden auch als Fettsäuren bezeichnet, anhand derer man Fette charakterisieren kann. Verbindungen dieser Art werden Triglyceride beziehungsweise Triacylglycerine genannt.

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Tricglyceride lassen sich allerdings chromatographisch nicht analysieren. Dafür bedarf es ihrer Spaltung und Derivatisierung: Die Esterverbindungen werden aufgebrochen und die freien Fettsäuren in korrespondierende Fettsäuremethylester (FAME, Fatty Acid Methyl Ester) überführt. Im Gegensatz zu den jeweiligen Fettsäuren sind FAMEs unpolar und moderat flüchtig und eignen sich für die GC-Analyse.

Der Schritt der Fettsäurenderivatisierung ist für gewöhnlich arbeitsintensiv; eine Automatisierung der Probenvorbereitung, wie es Colwell, Perkins, Summerhill und Angove unternommen haben, drängt sich geradezu auf. Die Wissenschaftler haben die vielfach beschriebene manuelle Derivatisierung mit Bortrifluorid und Methanol adaptiert und auf die MPS-Prepstation von Gerstel übertragen. Die Vergleichbarkeit war bei dieser Methode gewährleistet, wie die Ergebnisse zeigen.

Zunächst wurden die Fettproben in 10-mL-Vials mittels Accelerated Solvent Extraction (ASE) aufgeschlossen und mit deuterierten Fettsäuren versetzt. Die resultierenden Extrakte wurden bis zur Trockene eingedampft. Alle weiteren Schritte erfolgten automatisiert auf der MPS-Prepstation. Die Analyse erfolgte unter Zugabe von 1-Bromtetradecan als internem Standard.

Die technischen Details der Automationslösung

Entscheidend für die effiziente Automatisierung der Fettsäurenderivatisierung ist, dass sich alle erforderlichen Arbeitsabläufe auf dem Autosampler durchführen lassen. Die Prepstation verfügt über zwei übereinander gelagerte Achsen (Schienen), an denen sich jeweils ein Roboterarm entlang bewegt, der in allen drei Raumrichtungen agieren kann. „Während die obere Schiene etwa das gesamte Spektrum der Flüssigaufgabe abdeckt, inklusive Stan-dardaddition und Derivatisierung, kann die zweite Schiene eine weitere Möglichkeit der Probenanreicherung und Probenaufgabe bieten wie Headspace, SPME oder SBSE“, erklärt Ray Perkins. Die Plattform ermögliche es so, selbst komplexe Analysen effizient, komfortabel und zeitlich verschachtelt durchzuführen, was insbesondere dann interessant ist, wenn es sich um sensible, leicht zerstörbare Proben handelt und Substanzverlust im derivatisierten Zustand zu erwarten ist.

Die bei der Fettsäureanalytik eingesetzte Prepstation war mit einer 1-µL- und einer 10-µL-Spritze ausgestattet sowie mit zwei beheizbaren Agitatoren und einer Lösemittelstation, die Platz für vier Lösemittelbehälter bietet. Zwei enthielten Wasser der Qualitätsstufe HPLC-Grade, einer Aceton. Der in Hexan gelöste interne Standard sowie das Derivatisierungsreagenz (BF3 in Methanol) wurden in je einem 100-mL-Vial bevorratet. Kontrolliert und gesteuert wurde die Probenvorbereitung mittels der Gerstel-Maestro-Software. Die anschließende Analyse erfolgte auf einer Kombination GC 6890 und MSD 5973 von Agilent Technologies. „Unsere Gerätekonfiguration erlaubt es“, erklären die Wissenschaftler, „Probenvorbereitung, Probenaufgabe und Analyse nahtlos ineinander übergehen zu lassen oder wahlweise jeden einzelnen Schritt unabhängig voneinander, also die GC/MS-Analyse getrennt durchzuführen.“

Die 10-mL-Vials wurden von Hand auf die Prepstation überführt. Alle weiteren Schritte verliefen automatisiert: 1 mL der BF3/Methanol-Mischung wurde mit der 1-mL-Spritze dem Vorratsbehälter entnommen und zudosiert. Die Vials wurden zum ersten Agitator überführt, 50 Minuten bei 70 °C geschüttelt und wieder im Probentray positioniert: Die 1-µL-Spritze kam wieder zum Einsatz, um je 1 µL des internen Standards in die Probe zu dosieren. Gestoppt wurde die Derivatisierungsreaktion durch Zugabe von 3 mL HPLC-Wasser. Die Extraktion der Fettsäuremethylester erfolgte bei Raumtemperatur durch Schütteln im zweiten Agitator. Nach einer Standzeit von einer Minute im Probentray hatte sich die organische Phase abgesetzt; aus ihr wurde mit der 10-µL-Spritze 1 µL Extrakt entnommen und direkt in das GC/MS-System injiziert. Ein Teil des organischen Extrakts wurde von Hand entnommen und in 2-mL-Probenvials überführt, um anschließend die Wirkung der automatisierten Probenvorbereitung mit der des manuellen Prozesses vergleichen zu können.

Hoher Probendurchsatz, präzise und sichere Ergebnisse

„Da die Probenvorbereitung deutlich mehr Zeit in Anspruch nimmt als der GC-Lauf“, erklärt Ray Perkins, „bedeutet der Einsatz der MPS-Prepstation puren Zeitgewinn, verbunden mit einer signifikanten Steigerung der Produktivität.“ Dies liege an der intelligenten Softwaresteuerung, die über den Modus „PrepAhead“ verfügt. Hierdurch ist der Anwender in der Lage, beide Schritte – Probenvorbereitung und Analyse – zeitlich zu verschachteln; mehrere Proben lassen sich simultan bearbeiten, und die nächste kann just in dem Moment auf die Säule gegeben werden, wenn der vorherige GC-Lauf beendet ist.

Die Software erlaube es darüber hinaus, die Schritte der Probenvorbereitung genau zu planen. Nur so lasse sich die Kapazität des gesamten Analysesystems voll ausschöpfen. Dank eines speziellen Moduls, das in der Software integiert ist, hat der Anwender den Ablaufplan immer sichtbar auf dem Computerbildschirm. „Die Proben werden alle gleich behandelt und in kürzester Zeit abgearbeitet“, beschreiben Perkins und seine Kollegen die Vorgehensweise. Mehr noch: Eilige Proben lassen sich an beliebiger Stelle einfügen, ohne die Sequenz ab- oder unterbrechen zu müssen. Der Anwender erreiche damit maximale Effizienz und Flexibilität.

Fazit: Die bewährte manuelle Vorgehensweise bei der Derivatisierung von freien Fettsäuren in Fettsäuremethylester lässt sich auf der MPS-Prepstation erfolgreich automatisieren. Der Vergleich der Ergebnisse der manuellen mit den Ergebnissen der automatisierten Prozedur, bestätigt die Güte, Sensitivität und Präzision der automatisierten Vorgehensweise. „Die Automatisierung brachte wie erwartet eine bessere Wiederfindung sowie eine geringere Standardabweichung in allen Fällen“, schlussfolgern die Wissenschaftler und merken an, dass ein Teil der ohnehin geringen Schwankungsbreite in den Daten der avisierten endogenen Methylester sowieso mit der individuellen ASE jeder einzelnen Probe, die als Vorlage für die Derivatisierung diente, zusammenhinge.

*G. Deußing, Science-Communication Redaktionsbüro, 41464 Neuss,

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