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Probenvorbereitung in der HPLC Fraktionspooling, Verdampfung & Neuformatierung in der HPLC automatisieren

Autor / Redakteur: Induka Abeysena und Rob Darrington* / Dr. Ilka Ottleben

Eine neue, praktische Methode erlaubt die einfache Automatisierung von Umkehrphasen-HPLC-Fraktionspooling, Verdampfung und Neuformatierung. Etwaige Verluste bei den Ausbeuten, lassen sich dabei relativ einfach umgehen. Lesen Sie hier, wie.

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Abb. 1B: Das Rocket Evaporation System
Abb. 1B: Das Rocket Evaporation System
(Bild: Genevac)

Viele Labormitarbeiter und Wissenschaftler kennen dieses Problem: Proben aus der Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie (HPLC) werden aus der Chromatographiesäule in größeren Mengen gelöst als eine durchschnittliche Ampulle fasst. Normalerweise würden die Proben oder Fraktionen vor dem Pooling getrocknet und dann in einer geringen Menge Lösungsmittel wie Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst, in eine kleine Ampulle gegeben und dann getrocknet werden, um das DMSO zu entfernen. Doch dieser Prozess ist aufwändig und darüber hinaus fehleranfällig. Mit dem Sample-Genie-System von Genevac ist es möglich, große Mengen (bis zu 250 ml) direkt in die gewünschte Ampulle zu verdunsten.

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Sample-Genie (s. Abb. 1) wurde von Genevac speziell für Wissenschaftler entwickelt, die mit kleinen Ampullen arbeiten oder ihre getrockneten Proben in ihnen aufbewahren, wobei jedoch ihre Probe zunächst in einer großen Lösungsmenge gelöst ist. Sample-Genie ist im Wesentlichen eine Glasflasche, an der eine kleinere Ampulle befestigt werden kann, wobei eine inerte Dichtung für die Integrität der Verbindung sorgt [1]. Es wurde für die Nutzung mit den Verdampfern Genevac HT und EZ-2 sowie dem neuen Rocket-Schnell-Evaporationssystem [2] entwickelt. Zu Beginn der Entwicklung traten Probleme speziell mit Umkehrphasen-HPLC-Fraktionen auf, da ein Teil der Proben am Flaschenglas haften blieb, anstelle ganz in die Ampulle überzugehen. Im folgenden werden Ursachen und Lösung dieses Problems vorgestellt.

Problem: Abscheidung von Umkehrphasen-HPLC-Proben

Daten von Anwendungsbereichen außerhalb der Umkehrphasen-HPLC zeigten ein sehr hohes Niveau an Probenausbeute. Zwei derartige Bereiche sind die Umweltanalyse [1, 4] und Stoffwechselstudien [3], bei denen Ausbeuten von über 90% und 95% berichtet wurden. Für die meisten Wissenschaftler sind diese Werte ausreichend, da bei jeder Trocknungs- und Übertragungsmethode in eine Ampulle gewisse Verluste auftreten. Verluste lassen sich durch Waschen der Flasche minimieren. Dies könnte jedoch den Effizienzgewinn beeinträchtigen, der aus der Nutzung der Sample-Genie entsteht.

Zu beachten ist, dass bei Umkehrphasen-HPLC-Fraktionen die Proben gewöhnlich in einer Mischung aus Wasser und organischem Lösungsmittel (Acetonitrile oder Methanol) gelöst werden, wohingegen die Proben in den anderen Anwendungen normalerweise in einer organischen Einzellösung (oder einer Mischung aus ähnlichen Lösungsmitteln) gelöst werden. Zudem ist die Probenkonzentration bei der Umwelt- oder Stoffwechselanalyse normalerweise gering, einige Milligramm (mg) Probe pro 100 Milliliter (ml), während eine aufbereitete Probe Konzentrationen von 10 mg/ml oder noch mehr aufweisen kann.

Bei hohen Konzentrationen scheiden sich Proben aus der Lösung ab, bevor das Volumen klein genug ist, um nur die Ampulle zu füllen. Beim Verdampfungstrocknen erfolgt die Konzentration typischerweise bis zur Trocknung, und am Sättigungspunkt der Lösung wird sich die gelöste Probe absondern und an der Flasche haften (s. Abb. 2). Hinzu kommt, dass in der Vakuum-Verdampfung das organische Lösungsmittel schneller verdampft als das Wasser in der Fraktion. Sobald das gesamte organische Lösungsmittel verdampft ist, werden sich auch nicht in Wasser lösliche, nicht-polare Moleküle abscheiden.

„Antihaft-Beschichtung“ vs. Verhindern der Abscheidung

Es wurden unterschiedliche Lösungen für dieses Problem in Betracht gezogen und bewertet, die in zwei grundsätzliche Kategorien fallen: die Flasche „haftfrei“ zu machen oder zu verhindern, dass sich die Probe überhaupt erst abscheidet.

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Eine „haftfreie“ Lösung, die in Betracht gezogen wurde, bestand darin, die freien Silanolgruppen in den Glasmolekülen zu terminieren, meist mit einem Silan. Es wurden mehrere kommerziell erhältliche Behandlungen geprüft. Jedoch zeigte sich keine dieser Beschichtungen als erfolgreich. Die Proben schieden sich immer noch ab und hafteten immer noch an der Flaschenseite. Mit der Silanbehandlung wurde zwar erreicht, dass sich die ganze Probe näher am Flaschenhals befand, aber dies wurde nicht als ausreichend erachtet. Darüber hinaus war keine Behandlung dauerhaft, da sie mit dem Auswaschen der Flasche im Laufe der Zeit entfernt wurde. Die Flaschen wurden darüber hinaus auch mit einem Teflon-artigen Material beschichtet. Jedoch ergab sich für die Bereitsteller dieses Materials die Schwierigkeit, dafür zur sorgen, dass die Beschichtung am Glas haften blieb, und es bestand das Risiko des Abblätterns. Diese Lösung wurde also verworfen.

Die vielversprechendste Lösung bestand darin, zu verhindern, dass sich die Lösung überhaupt erst abschied. Es wurde ein Lösungsmittel beigegeben, welches dafür sorgt, dass die Probe gelöst bleibt. Ein derartiges Lösungsmittel erfordert einen ähnlichen Siedepunkt wie Wasser, damit es nicht mit dem Acetonitril verdampft. Es wurden zwei Lösungsmittel in Betracht gezogen, Toluol und 1,4-Dioxan. Erste Testreihen mit Toluol schlugen fehl, weil Toluol nicht mit Wasser mischbar ist. 1,4-Dioxan hingegen war viel erfolgreicher.

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Experimente mit Zusatzlösungsmitteln

Es wurden eine Reihe von Experimenten mit dem Rocket-Evaporation-System und dem Sample-Genie durchgeführt. In dieser Studie wurden drei Standardverbindungen verwendet. Jede davon wurde für einen unterschiedlichen Lösungsmittelbereich ausgewählt, basierend auf der Löslichkeit und darauf hin, wo sie sich am wahrscheinlichsten in einer gradierenden Umkehrphasen-HPLC herauslösen würden.

Diese Versuchsreihen wurden mit zwei Fraktionsvolumen, 100 ml und 200 ml, durchgeführt, wobei jeweils 100 mg und 200 mg der Standardverbindungen verwendet wurden. Für alle Experimente wurde die HPLC-Fraktionsmethode bei 40 °C verwendet. Die Ausbeutegrade, die in der Ampulle gesammelt wurden, lagen bei 97 bis 100% (s. Tabelle 2).

Die Menge des benötigten 1,4-Dioxan hängt vom Volumen in der Ampulle und der Wassermenge in der Probe ab. Um zu bestimmen, wie viel 1,4-Dioxan erforderlich ist, sollte zuerst die Probe mit der geringsten Menge Acetonitril und anschließend je nach Volumen die entsprechende Menge 1,4-Dioxan aus der Nachschlagetabelle (s. Tabelle 3) gewählt werden. Obwohl 1,4-Dioxan (SP 101°C) einen ähnlichen Siedepunkt wie Wasser aufweist, wird es aufgrund der niedrigen Verdampfungswärme schneller verdampfen. Bei hydrophobischen Verbindungen muss also vorsichtiger vorgegangen werden, um ein Haften an der Flasche zu verhindern.

* Dr. I. Abeysena, R. Darrington: Genevac Ltd, IP1 5AP Ipswich, Großbritannien

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