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FRET-Mikroskopie FRET-Mikroskopie spürt Botenstoffe in Bakterien auf

Autor / Redakteur: Matthias Christen* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

In Forschung und Drug Discovery gewinnen bioanalytische Nachweismethoden für zelluläre Signalstoffe immer mehr an Bedeutung. Lesen Sie, wie die FRET-Mikroskopie mit neu entwickelten Biosensoren bakterielle Botenstoffe in einzelnen Zellen aufspüren und Konzentrationsunterschiede von wenigen Hundert Molekülen pro Zelle messen kann.

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In den letzten Jahren etablierte sich die Methode der Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer-Mikroskopie (FRET) als ein potentes bioanalytisches Nachweisverfahren zur Aufklärung und Beobachtung von Signalprozessen in lebenden Zellen. Genetisch kodierte FRET-Biosensoren haben das Verständnis von zellulären Signalübertragungen in eukaryotischen Zellen revolutioniert und bewiesen, dass sekundäre Botenstoffe zeitlich und örtlich innerhalb von Zellbereichen fluktuieren. Allerdings haben FRET-basierte Nachweisverfahren den Sprung zu den Bakterien bisher nicht geschafft. Das hat unter anderem damit zu tun, dass eine bakterielle Zelle mit einem Durchmesser von 1 bis 2 Mikrometer unter dem Mikroskop ein vielfach schwächeres Fluoreszenzsignal generiert als eine tierische Zelle. Um Botenstoffe in einzelnen Bakterien im nanomolaren Konzentrationsbereich nachzuweisen, muss die FRET-Bioanalytik Unterschiede von 100 bis 200 Signalmolekülen pro Zelle auflösen können.

DNA-codierte Biosensoren

Neu entwickelte Biosensoren für das zyklische di-GMP (c-di-GMP, s. Hintergrundkasten), ermöglichen nun FRET-mikroskopische Beobachtungen von bakteriellen Botenstoffen. Damit lassen sich Entscheidungsprozesse, welche in einzelnen lebenden Bakterien ablaufen, über einen langen Zeitraum unter dem Mikroskop beobachten. Abbildung 2 zeigt schematisch das Prinzip des FRET-Biosensors und illustriert, wie die Bindung des Botenstoffes c-di-GMP an eine interne Rezeptor-Domäne eine Veränderung der FRET-Effizienz zwischen den beiden cyan und gelb fluoreszierenden Proteinen (CFP und YFP) induziert. In Abwesenheit des Botenstoffes sind die beiden Fluoreszenz-Untereinheiten nahe beieinander und FRET ist maximal. Die Bindung von c-di-GMP induziert eine konformationelle Änderung im Biosensor, welche die CFP- und YFP-Domänen voneinander entfernt und folglich die FRET-Effizienz verringert. Dadurch lassen sich molekulare Bindungszustände direkt mittels Messung der Fluoreszenz-Spektren bestimmen. Im Fluoreszenz-Spektrum in Abbildung 2 sind die Veränderungen unter Verwendung von 50 nM Biosensor und zunehmender Botenstoffkonzentration ersichtlich. Wird das Verhältnis der Emissions-Maxima der beiden Fluorophore (527 nm und 485 nm) gegen die Konzentration an Botenstoff aufgetragen, erhält man eine Bindungskurve, welche zur Kalibrierung der FRET-mikroskopischen Messungen herangezogen werden kann. Dazu wird der genetisch kodierte Biosensor in Bakterien exprimiert und FRET-ratiometrisch in den Fluoreszenz-Kanälen bestimmt.

Bildergalerie

Abbildung 1 zeigt eine Aufnahme von sich teilenden Zellen des Krankeitserregers Pseudomonas aeruginosa, der in der Lunge zu Biofilmbildung und schweren Infektionen führen kann. Die FRET-Mikroskopie macht Signalvorgänge in einzelnen Zellen sichtbar und vermittelt den Forschern ein Bild von der heterogenen Botenstoffverteilung innerhalb einer Zellkultur. Werden, wie in Abbildung 3 gezeigt, sich teilende Zellen über einen längeren Zeitraum unter dem Mikroskop beobachtet, können Botenstoffveränderungen innerhalb von Zellen verfolgt werden. Aufgrund von solchen Aufnahmen gelang es, zu zeigen, dass der bakterielle Botenstoff c-di-GMP während der Zellteilung asymmetrisch auf die beiden Tochterzellen verteilt wird. Jeweils eine Tochterzelle (rot) weist c-di-GMP-Konzentrationen von unter 100 nM auf und entwickelt sich dadurch zu einer schwimmenden virulenten Zelle. Die andere Tochterzelle (grün) hat eine fünfmal höhere Botenstoffkonzentration und entwickelt einen sesshaften, biofilmbildenden Zelltyp aus. Solche zellspezifischen Unterschiede in Botenstoffverteilungen konnten bisher in Bakterien nicht beobachtet werden. Dies zeigt eindrücklich das Potenzial der FRET-Mikroskopie zum Studium von bakteriellen Signalkaskaden auf. Damit können mit dieser Technik Konzentrationsunterschiede von 1 bis 2 Signalmolekülen pro Pixel Auflösung gemessen werden. Limitiert wird die derzeitige Nachweisgrenze einzig durch die Belichtungszeit der EM-CCD-Kamera von 100 bis 200 Millisekunden und damit vom Diffusionsweg der Biosensoren und Signalmoleküle innerhalb der beobachteten Zellen.

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Hochdurchsatz-Screening

Nicht nur in der Mikroskopie sondern auch für Hochdurchsatz-Screenings lassen sich FRET-Biosensoren einsetzen. Die Wirkstoffsuche fordert robuste Analysemethoden mit hohem Probendurchsatz für das biochemische Wirkstoff-Screening. Unter Verwendung von Fluoreszenz-Spektrometern können Signalstoffe innerhalb komplexer Proben (in Zellkulturen oder Zellextrakten) im Millisekunden-Bereich detektiert werden. Von Vorteil ist hier, wenn der Fluoreszenz-Reader mit dichroitischen Spiegeln und zwei parallelen Photomulti-pliern (PMT’s) ausgestattet ist. Dann können die beiden Fluoreszenzkanäle (CFP und FRET) simultan gemessen werden, was kleinere Messfehler und schnellere Messungen erlaubt. Im Gegensatz zu Nachweisverfahren wie ELISA oder Bead-basierten Assays (z.B. Alphascreen von Perkin Elmer), misst der FRET-Biosensor keine Probenmengen, sondern freie Konzentrationen an Signalstoffen. Bleaching-Effekte, wie sie z.B. bei der Alpha-Screening-Technologie vorkommen, sind vernachlässigbar. Dadurch werden neben Endpunkt-Messungen auch kinetische Messungen im Multi-Well-Format möglich.

Die ablaufende enzymatische Produktion des Botenstoffes kann somit während verschiedener Zeitpunkte in Echtzeit verfolgt werden. Abbildung 4 veranschaulicht Enzymkinetiken im 384-Well-Format, welche unter Verwendung von 50 nM-Biosensor in einem Probenvolumen von 5 µl aufgezeichnet wurden. Mit dieser Hochdurchsatz-Methode erhoffen sich Infektionsforscher neuartige Wirkstoffe zu finden, welche die Synthese von c-di-GMP in den Bakterien blockiert. Denn ohne diesen Botenstoff bilden bakterielle Krankheitserreger keine Biofilme. Damit wäre ein wichtiger Verteidigungs-Mechanismus ausgeschaltet und herkömmliche Antibiotika könnten effektiver eingesetzt werden.

Neben c-di-GMP, existieren bisher für viele andere zelluläre Botenstoffe keine geeigneten Nachweisverfahren. Vor allem für kleine biologische Moleküle lassen sich wegen ihrer geringen Antigenizität oft keine brauchbaren Antikörper herstellen. Folglich bringen ELISA-basierte Nachweismethoden dann nicht den gewünschten Erfolg. In diese Lücke könnten in Zukunft FRET-basierte Biosensoren springen, denn oft sind zelleigene Rezeptorproteine bekannt, welche den Signalstoff mit hoher Affinität binden. Ist dies der Fall lassen sich mit relativ geringem Aufwand FRET-Biosensoren durch Einfügen der Rezeptorproteine zwischen die beiden Fluoreszenzproteine CFP und YFP generieren. Man darf gespannt sein, welche Fortschritte sich in Zukunft mit FRET-basierten Biosensoren in Mikroskopie und Wirkstoffsuche erzielen lassen.

Literatur

[1] Christen et al., Asymmetrical Distribution of the Second Messenger c-di-GMP upon Bacterial Cell Division, Science 4 June 2010: Vol. 328. no. 5983, pp. 1295 - 1297, DOI: 10.1126/science.1188658

*Dr. M. Christen, 4153 Reinach/Schweiz

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