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Meilenstein Mikroskopie Fundamentales Verständnis für tiefe Einblicke in den Mikrokosmos

Autor / Redakteur: Dr. Ilka Ottleben* / Dr. Ilka Ottleben

Woraus besteht der Mensch, seine Organe, sein Blut? Wie funktioniert Leben? Die Beantwortung vieler fundamentaler Fragen der Menschheit wäre ohne die Mikroskopie nicht denkbar. Eine Technik, die revolutioniert wurde, als man sie erstmals auf ein wissenschaftliches Fundament stellte.

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Abb. 1: Wo alles begann – Die Optische Werkstätte im Jena des 19. Jahrhunderts.
Abb. 1: Wo alles begann – Die Optische Werkstätte im Jena des 19. Jahrhunderts.
(Bild: Zeiss)

Jena in der Mitte des 19. Jahrhunderts. Die Stadt an der Saale, der Goethe einst respektvoll den Beinamen „Stapelstadt des Wissens“ gab, war zu jener Zeit zumindest in wirtschaftlicher Hinsicht dominiert durch ihre Universität und kleinere Handwerksbetriebe, die zum Teil von Aufträgen mit wissenschaftlichem Bezug lebten. Weit über die Stadtgrenzen von Jena hinaus war dies indes eine Zeit des Aufbruchs in Naturwissenschaften und Medizin: Forscher begannen den fundamentalen Aufbau lebender Organismen zu verstehen, die Bedeutung des Begriffs „Zelle“ formte sich mehr und mehr.

In diesem Umfeld eröffnete der 30-jährige Carl Zeiss (1816 – 1888) am 17. November 1846 in der Jenaer Neugasse 7 eine Werkstatt für Feinmechanik und Optik – Grundstein und Wiege einer bis heute über 170 Jahre andauernden Unternehmensgeschichte.

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Den Mikrokosmos erforschen – wie alles begann

Die Anfänge der Mikroskopie reichen bis in die Mitte des 17. Jahrhunderts zurück und ihre lange Geschichte zeigt, dass es in der Natur des Menschen zu liegen scheint, das für das menschliche Auge unauflösbar Kleine – den Mikrokosmos – sichtbar machen zu wollen. Doch erst die zunehmende Bedeutung und Fortschritte in der naturwissenschaftlichen Forschung und Medizin zu Beginn des 19. Jahrhunderts machten aus einem Apparat, der ehemals eher der Belustigung diente, ein äußerst wichtiges wissenschaftliches Instrument. Und so wandte sich Carl Zeiss im Jahr 1847 auf Rat seines akademischen Lehrers Matthias Jacob Schleiden (1804 – 1881), Botaniker und Mitbegründer der Zelltheorie, dem Bau einfacher aber präziser Mikroskope zu. Durch seine Sorgfalt machte er sich schnell einen Namen, Bedarf und Nachfrage bestätigten seinen Entschluss. Doch nur mit zusammengesetzten Mikroskopen ließen sich auch höhere Vergrößerungen erreichen. Wollte Zeiss seiner Konkurrenz nicht unterliegen, musste auch er zusammengesetzte Mikroskope bauen – 1857 wird das Stativ I zum ersten technischen Meilenstein des noch jungen Unternehmens.

Mikroskop-Objektive wurden zu jener Zeit typischerweise durch die Kombination achromatischer Linsen sehr mühsam durch „Pröbeln“, das heißt durch Ausprobieren unterschiedlicher Linsenkombinationen, experimentell entwickelt. Ein Umstand, der einer stabilen Fertigung und besseren optischen Eigenschaften entgegen stand. Die Notwendigkeit erkannt zu haben, die Konstruktion mikroskopischer Optik auf ein solides wissenschaftliches Fundament zu stellen, ist eine der fundamentalen Leistungen von Carl Zeiss. Seine Entscheidung, bei der Entwicklung von Instrumenten eng mit der Wissenschaft zusammenzuarbeiten, hatte Meilenstein-Charakter und gehört bis heute zu den Grundmaximen des Unternehmens. Sie führte zu einer engen und fruchtbaren Zusammenarbeit mit dem Physiker Ernst Carl Abbe (1840 – 1905), bis dahin Privatdozent an der Universität Jena. Ihn holte Zeiss 1866 zunächst als wissenschaftlichen Mitarbeiter, ab 1876 dann als stillen Teilhaber ins Unter­nehmen.

Frühe Wegbegleiter – Abbe und Schott

Bei Zeiss wandte Abbe sich Ende der 1860er Jahre der Berechnung optischer Systeme zu. Die Ergebnisse waren bahnbrechend und führten zum grundlegenden Verständnis mikroskopischer Bildtheorien. Das Abbesche Auflösungslimit besagt, dass die Wellennatur des Lichtes der Erkennbarkeit feiner Strukturen, die kleiner als die halbe Wellenlänge des Lichtes sind, natürliche Grenzen setzt. Er fand im Verlauf seiner Untersuchungen die Formel für die (Abbesche) Sinusbedingung als Kriterium für eine scharfe Abbildung in der Umgebung der optischen Achse und prägte den Begriff der numerischen Apertur (N.A.). Auf ihn geht letztlich die Erkenntnis zurück, dass unter optimalen Bedingungen, bei Verwendung von violettem Licht und einer numerischen Apertur von 1,4 im Lichtmikroskop theoretisch ein Auflösungsvermögen von etwa 0,2 µm erreicht werden kann.

Ab 1872 wurden bei Zeiss Mikroskope nun auf Basis wissenschaftlicher Berechnungen gefertigt – mit wesentlich besseren optischen Eigenschaften. 1877 folgte das erste homogene Öl-Immersionsobjektiv. Es legte die Grundlage für die heute in fast allen Laboren angewendete Ölimmersion und führte neben anderen Vorteilen zu deutlich verbesserten Auflösungen.

Ernst Abbe war inzwischen in der Lage, Mikroskop-Objektive so zu berechnen, dass einige wichtige Abbildungsfehler umgangen werden konnten. Nun limitierte die Qualität optischer Gläser die konsequente Nutzung seiner Erkenntnisse. Hier erwies sich der Umstand als hilfreich, dass der junge Chemiker Otto Schott (1851 – 1935) zu jener Zeit eine neue Glassorte erschmolzen hatte, die für optische Zwecke geeignet schien. Gemeinsam richtete man 1882 ein glastechnisches Laboratorium in Jena ein. Seine folgenden Arbeiten erlaubten die Herstellung eines Glases mit homogenen, exakt bestimmbaren, optischen Eigenschaften. Der Grundstein für die 1886 erstmals vermarkteten Mikroskop-Objektive eines völlig neuen Typs – die Apochromate – war gelegt.

Webgereiter für die Forschung

Das grundlegende Verständnis optischer Theorien verschaffte nicht nur Zeiss als Unternehmen einen deutlichen Technologievorsprung vor seinen Wettbewerbern, sondern ermöglichte auch bahnbrechende Arbeiten in Naturwissenschaften und Medizin. Robert Koch entdeckte in den 1880er Jahren die Erreger von Tuberkulose und Cholera, wofür er 1905 den Nobelpreis für Medizin erhielt. In einem Brief an Carl Zeiss schrieb er 1904 dazu: „Verdanke ich doch einen großen Teil der Erfolge, welche mir für die Wissenschaft zu erringen vergönnt war, ihren ausgezeichneten Mikroskopen.“ Bereits im folgenden Jahr 1906 erhielt Santiago Ramón Y Cajal, spanischer Neurowissenschaftler und Histologe, gemeinsam mit Camillo Golgi den Nobelpreis für Physiologie und Medizin für seine fundamentalen Arbeiten zu Aufbau und Feinstruktur des Nervensystems. Auch Cajal hatte u.a. ein Mikroskop von Zeiss verwendet. Bis heute haben über 30 Nobelpreisträger für ihre Forschungen unter anderem auf Zeiss-Technologie vertraut.

Die enge Zusammenarbeit von Forschung und Industrie als Fundament und wichtiger Antrieb für Technologieentwicklungen, verbunden mit dem Ziel, den Mikrokosmos erforschbar zu machen und dabei Grenzen zu überschreiten – diesen Anspruch haben die Gründerväter Zeiss und Abbe ihrem Unternehmen gewissermaßen in die Wiege gelegt. Seit 1889 ist dieser auch festgeschrieben in der Carl-Zeiss-Stiftung, die Abbe ein Jahr nach dem Tod von Zeiss gründete und der er 1891 seine Vermögensanteile an der Optischen Werkstätte und am Jenaer Glaswerk übertrug. Sie sollte auch dazu dienen, an der Jenaer Universität die naturwissenschaftliche Forschung zu fördern. Bis heute schüttet die Carl Zeiss AG eine Dividende an die Carl-Zeiss-Stiftung aus, die damit Forschung und Lehre fördert.

Zunehmende Diversifizierung des Portfolios

Ende des 19. Jahrhunderts war das Mikroskop inzwischen nicht mehr nur wichtiges Instrument für wissenschaftliche Zwecke, sondern auch im Alltag von Medizinern, Hygienikern und Werkstoffprüfern angekommen. Die Gründung der ersten ausländischen Tochtergesellschaft 1894 in London markierte den Beginn der globalen Expansion.

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1896 fertigte Zeiss auf Anregung des amerikanischen Entomologen Horatio S. Greenough das erste Stereomikroskop nach dem nach ihm benannten Prinzip. Zudem begann in dieser Zeit der Bau von bedarfsgerechten, maßgeschneiderten Spezialkonstruktionen. Das erlangte Wissen und die technologischen Möglichkeiten wurden zudem auf andere Produkte wie Ferngläser, Fotoobjektive, astronomische Geräte, Spektroskope oder geodätische Geräte angewendet, was neue Geschäftsfelder eröffnete.

Die Erfindung des Ultraviolett-Mikroskops 1904 durch August Köhler und Moritz von Rohr und der Versuchsaufbau zur Fluoreszenzmikroskopie von Köhler und Henry Siedentopf aus dem Jahr 1908 verbesserten indes die Möglichkeiten der Lichtmikroskopie durch Nutzung neuer Lichtquellen weiter.

Der erste Weltkrieg unterbrach die Arbeit an „Zivilgeräten“ vorübergehend, doch schon im Jahr 1933 wird das berühmte L-Stativ zum Vorbild im Mikroskopbau. Im weiteren Verlauf der Geschichte sollten mit Teilung und Wiedervereinigung Deutschlands zwei weitere historische Ereignisse die Unternehmens­entwicklung maßgeblich prägen.

Erfindung des Phasenkontrastes – Zusammenarbeit mit Frits Zernike

Das Abbesche Auflösungslimit besagt bekanntlich, dass ein Lichtmikroskop Details im Abstand von 0,2 µm auflösen kann. Eine typische tierische Zelle hat einen Durchmesser von 10 bis 20 µm und ist damit fünfmal kleiner als ein mit dem bloßen Auge eben noch erkennbares Teilchen, liegt jedoch noch oberhalb dessen, was ein Lichtmikroskop in der Lage ist aufzulösen. Ihre Zellstrukturen sichtbar zu machen, wird da schon schwieriger, noch schwieriger die Funktionen der verschiedenen Zellkomponenten zu verstehen. Hinzu kommt, dass tierische Zellen farblos und durchsichtig sind, also kaum Licht absorbieren. Zytologen beunruhigte aber, dass durch Fixierung und Färbung der Zellen ihre Komponenten (und Funktionen) möglicherweise verändert würden oder verloren gingen. Verfolgt man die Entwicklung der Mikroskopie also anhand dieses Beispiels der Zellbiologie weiter, wird schnell deutlich, dass das Fortschreiten der Wissenschaft alsbald auch von der Entwicklung neuer Kontrastmethoden und nicht zuletzt auch neuer Strahlungsquellen abhing.

Das waren Bedürfnisse, die natürlich auch Zeiss adressierte. Zu einem Durchbruch hinsichtlich der kontrastreichen Darstellung transparenter Objekte verhalf dem Unternehmen die Zusammenarbeit mit dem niederländischen Physiker Frits Zernike. Er entdeckte 1930 bei der Arbeit mit Reflexionsgittern, dass er die Phasenlage der einzelnen Lichtstrahlen beobachten konnte. Um diesen Effekt der Mikroskopie zugänglich zu machen, entwickelte er gemeinsam mit Zeiss das erste Phasenkontrastmikroskop, dessen Prototyp im Jahr 1936 entstand. Es ermöglichte die Untersuchung lebender Zellen, ohne sie dabei durch Färbung zu schädigen.

Die Automatisierung der Mikroskopie wird gefragter

Was ist das Problem der Anwender und wie kann Zeiss helfen, es zu lösen? Sich diese Frage zu stellen, ist eine weitere frühe Grundmaxime des Unternehmens. Bereits in der 1930er Jahren vereinfachten nun speziell entwickelte Fotoapparate das Festhalten und Dokumentieren der mikroskopischen Abbildungen. Dieser Fortschritt sollte die Nutzer vom mühsamen und mitunter ungenauen Abzeichnen der Mikroskopbilder befreien.

Das Zeitalter des Wirtschaftswunders, mit seinen erweiterten Möglichkeiten in der Elektronik sollte schließlich erste Schritte hin zu einer stärkeren Automatisierung der Mikroskopie ermöglichen. 1955 wurde ein vollkommen neues Photomikroskop mit integrierter Kamera und automatischer Beleuchtungssteuerung eingeführt.

Das Zeitalter der Elektronik erfasst auch die Mikroskopie

Gleichzeitig arbeitete Zeiss in dieser Zeit der Elektronik sehr stringent an der Diversifizierung und Komplettierung seines Mikroskopie-Portfolios durch Nutzung anderer Formen der Strahlung für die Bild­erzeugung. Um im Bild der Zellbiologie zu bleiben – für den Blick in die Feinstruktur einer Zelle bedarf es, wie oben beschrieben, auch eines großen Auflösungsvermögens der Systeme. Die von Abbe postulierte Beziehung zwischen Auflösungsgrenze und Wellenlänge des eingestrahlten Lichtes gilt für jede Form von Strahlung. Ergo kann die Grenze der Auflösung bei Verwendung von Elektronen sehr klein, das Auflösungsvermögen also sehr groß werden. Grob gesagt etwa 100 mal besser als im Lichtmikroskop. Eine Spanne, welche die Informationstiefe immens vergrößert.

In den 1940er Jahren begann Zeiss auf dem Gebiet der Elektronenmikroskopie eine Zusammenarbeit mit AEG. Eine wesentliche Herausforderung bestand darin, dass Fehler von Elektronenlinsen deutlich schwerer zu korrigieren sind als die von Glaslinsen. Bereits 1949 stellte das Unternehmen mit dem EM 8 das erste statisch korrigierte Transmissionselektronenmikroskop (TEM) vor und legte damit den Grundstein für die Elektronenmikroskopie bei Zeiss. Das Nachfolgermodell von 1956, das EM 9, war das weltweit erste elektromag­netische TEM mit automatischer Belichtungskontrolle. 1984 führte Zeiss mit der Vorstellung des EM 902 den Castaing-Henry-Filter für kommerzielle Elektronenmikroskope ein. Mit dieser Neuerung wurde es dem Benutzer nun möglich, hochauflösende Elementverteilungsbilder anzufertigen.

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1993 folgte die Markteinführung des Feldemissions-Rasterelektronenmikroskops DSM 982 Gemini mit kombinierter elektrostatisch-magnetischer Objektivlinse (Gemini-Technologie).

Mit dem Orion-Mikroskop brachte Zeiss 2007 schließlich ein System auf den Markt, welches die Proben mit Helium-Ionen anstelle von Elektronen abtastet und dadurch eine weitaus höhere Auflösung und höheren Kontrast lieferte. Das war der Markteinstieg in die Helium-Ionenmikroskopie. Das Crisp-System aus demselben Jahr besitzt als einziges TEM der Welt die Fähigkeit, auf atomarer Ebene abzubilden.

In der Gegenwart der Elektronenmikroskopie angekommen, arbeitet das neueste Rasterelektronenmikroskop Zeiss MultiSEM 505 (s. LP-Tipp-Kasten) als erstes REM der Welt mit 61 Strahlen parallel und erreicht so eine Aufnahmegeschwindigkeit von 1220 Megapixeln pro Sekunde bei einer Pixelgröße von 4 nm. Dies machen sich z.B. Hirnforscher bei der Abbildung neuronaler Netzwerke zunutze. Sie können damit sehr viel größere Proben als bisher untersuchen, die bislang jahrelange Aufnahmezeiten erfordert hätten.

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LP-Tipp  Vielstrahl-Elektronenmikroskopie

Die Zeiss MultiSEM-Technologie arbeitet mit einer großen Zahl von parallelen Elektronenstrahlen (Beleuchtungspfad) und Detektoren. Ein fein abgestimmter Detektionspfad erfasst große Mengen von Sekundär­elektronen (SE). Jeder Strahl führt eine synchronisierte Scanning-Routine an einer Probenposition aus, wodurch sich ein einzelnes Unterbild ergibt. Die Elektronenstrahlen sind in einem sechseckigen Muster angeordnet. Das vollständige Bild wird durch Verbindung aller Bildkacheln gebildet. Für die schnelle Datenaufzeichung wird eine parallele Computerkonfiguration verwendet, was die gesamte Imaging-Geschwindigkeit erhöht. Bildaufnahme und Workflow-Kontrolle sind vollständig getrennt.

Auch den Bereich der Röntgenmikroskopie kann Zeiss seit 2013 adressieren und bietet mit der Versa-Reihe moderne Systeme für die hochauflösende 3D-Röntgenmikroskopie im Sub-Mikrometerbereich.

Die Mikroskopie wird räumlich

Die Anforderungen großer, dicker Proben waren indes auch im Bereich der Lichtmikroskopie wichtiger Fokus für stringente Weiterentwicklungen. Solche Proben mussten bislang für die lichtmikroskopische Untersuchung in dünne Scheiben geschnitten werden. Doch beim Schneiden geht die Information über die räumliche Anordnung verloren.

1982 führte Zeiss das konfokale Laser-Scanning-Mikroskop (LSM) mit Objektabtastung durch einen oszillierenden Laserstrahl und elektronischer Bildverarbeitung ein und schuf damit einen bis heute aktuellen Gold-Standard im Markt. Die konfokale Lasertechnik erlaubt es, dass nur Licht aus einem kleinen Volumen um den Fokuspunkt zum Detektor gelangt, sodass optische Schnittbilder mit hohem Kontrast erzeugt werden können, die fast nur Licht aus einer schmalen Schicht um die jeweilige Fokusebene enthalten. So konnte man einerseits störende fluoreszente Unschärfen effektiv ausblenden, ohne auf dünne Schnitte zurückgreifen zu müssen, andererseits ließen sich so große, dicke Proben in viele optische Schnitte zerlegen. Man erhielt auf diese Weise komplexe 3D-Informationen und mithilfe entsprechender Software ließen sich nun räumliche Abbildungen der Präparate erstellen. Computer- und Lasertechnologie entwickelten sich rasant weiter. Heutige Systeme sind um zahlreiche Funktionalitäten, bis hin zum linearen Scannen von Proben oder Lasermanipulationen an Zellstrukturen, erweitert.

Von Live-Cell-Imaging bis Superauflösung

In der Fluoreszenzmikroskopie lebender Zellen, Gewebe oder Organismen waren phototoxische und Ausbleicheffekte bzw. die daraus resultierenden Informationsverluste ein zentrales Problem der Anwender, das es zu lösen galt. Je länger Forscher lebende Objekte unter möglichst physiologischen Bedingungen beobachten können, desto höher der Informationsgehalt, will man Einblicke in die Prozesse lebender Zellen und Organismen gewinnen. Imaging-Systeme, die diese Lichtbelastung auf ein Minimum reduzieren, waren somit gefragt. Lichtblattfluoreszenzmikroskope mit dem aktuellsten Vertreter Zeiss Lightsheet Z.1, teilen die Fluoreszenzanregung und -detektion in zwei separate Lichtwege, wobei die Beleuchtungsachse senkrecht auf der Detektionsachse steht. So wird jeweils nur ein einzelner, dünner Bereich der Probe beleuchtet. Die Systeme erlauben es, optische Schnitte großer Proben schonend, d.h. mit geringer Lichtbelastung und dabei hoher zeitlicher Auflösung durchzuführen. Mit den aktuellen Systemen lassen sich lebende Objekte über Tage hinweg in 3D und aus verschiedenen Blickwinkeln verfolgen.

Daneben stand natürlich immer das große Thema Auflösung: Das Abbesche Auflösungslimit schien höhere Auflösungen im Bereich der Lichtmikroskopie zu verhindern. Eric Betzig und Kollegen gelang es schließlich im Jahr 2006 mit der Photoactivated Localization Microscopy (PALM), auf Basis des lichtgesteuerten Ein- und Ausschaltens von Fluoreszenz in einzelnen Molekülen, das Abbesche Auflösungslimit zu umgehen und um ca. Faktor 10 unter die magische Grenze von 200 nm zu gelangen. Seine Arbeit zur superauflösenden Mikroskopie wurde im Jahr 2014 zusammen mit der von Stefan W. Hell und William E. Moerner mit dem Nobelpreis für Chemie gewürdigt. Zeiss erwarb die Exklusivlizenz für PALM. Das Mikroskopsystem Elyra PS.1 ermöglicht mit dieser Technologie die Einzelmoleküllokalisation.

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Alle diese Entwicklungen waren ab den 1990er Jahren begleitet von einer zunehmenden und heute in vielen Bereichen vollständigen Digitalisierung. Mikroskope wurden zu Imaging-Arbeitsstationen mit vollkommen neuen Möglichkeiten der Bildaufnahme, Datenverarbeitung und Datenspeicherung.

Aufbruch in die Zukunft

Das neue Jahrtausend ist geprägt von Nanotechnologie und einer sich rasant entwickelnden Computer- und Speichertechnik. Neue Elektronen- und Ionenmikroskopiesysteme erlauben mit bisher unerreichter Auflösung und Datenqualität neue Einblicke in diesen sich immer weiter öffnenden Kosmos. Verbunden auch mit Funktionen, die über das reine Imaging hinausgehen. Rasterelektronenmikroskope mit fokussiertem Ionenstrahl (FIB-SEM), beispielsweise Zeiss Cross­beam, erlauben die Strukturierung neuer Oberflächen und Nanomaterialien, mit zahlreichen Anwendungen in Bereichen wie Halbleiter, Elektronik oder E-Mobilität.

Heutige Mikroskopiesysteme erzeugen in immer kürzerer Zeit, immer mehr Daten – in 3D und 4D. Bildaufnahme und Bildverarbeitung werden hochgradig parallelisiert, deutlich höhere Durchsätze erreicht. Neueste Technologien wie die Airyscan-Technik für Zeiss LSM 800 beziehungsweise LSM 880 ermöglichen zudem höchste Aufnahme- und Scangeschwindigkeiten.

Der Trend hin zur Automatisierten Mikroskopie auch für die Routine-Anwendung ist dabei ungebrochen – ein Trend, den Zeiss aktuell mit dem neuesten Modell eines so genannten „Box-Mikroskopes“, dem Zeiss Celldiscoverer 7, adressiert (s. Abb. 4 und Infografik LP 5/2017). Das System erreicht einen sehr hohen Automatisierungsgrad, ohne dass der Benutzer auf die Bildqualität und Flexibilität eines traditionellen, inversen Forschungsmikroskops für die Lebendzellmikroskopie verzichten muss.

Neue Technologien in der Licht-, Elektronen-/Ionen- und Röntgenmikroskopie ermöglichen dabei immer detailliertere Einblicke. Die Lücken zwischen diesen mikroskopischen Techniken zu schließen bzw. sie sinnvoll miteinander zu verknüpfen, wird in den kommenden Jahren Aufgabe der korrelativen Mikroskopie sein, die sich seit einigen Jahren als aufkommender Trend abzeichnet. Über strukturelle Korrelationen, die Suche nach Strukturen in verschiedenen Längenskalen – gewissermaßen die Suche nach der sprichwörtlichen Nadel im Heuhaufen – deutlich zu beschleunigen oder über funktionelle Korrelationen bestimmten Strukturen spezifische Funktionen zuweisen zu können, wird die Forschung weiter vorantreiben und sicherlich wiederum Grenzen verschieben.

Vielleicht hatte Ernst Abbe bereits einige dieser Entwicklungen im Sinn, als er einst meinte: „Abgesehen von ihrem Namen werden die Mikroskope der Zukunft nicht mehr viele Dinge mit den heutigen gemeinsam haben“.

* Dr. I. Ottleben: Redaktion LABORPRAXIS, E-Mail ilka.ottleben@vogel.de

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