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Drogenanalytik GC/MS-Screening von Gewebe auf Drogen- und Arzneimittelrückstände

Autor / Redakteur: Oliver Lerch* und Susanne Sperling* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Die Stir Bar Sorptive Extraction (SBSE) ist eine im forensisch-toxikologischen Labor neue und effiziente Methode zur Extraktion von Blut-, Urin- und Gewebeproben beim Drogen- und Arzneimittelscreening. Kombiniert mit einer passgenauen Desorptionsmethode liefert sie bei einfacherer Handhabung ebenso gute Ergebnisse wie bekannte Routine-Extraktionsmethoden und verzichtet dabei auf den Gebrauch von Lösungsmitteln.

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Abb. 1: Forensisch-toxikologische Analysen weisen u.a. Arzneimittelrückstände in Körperflüssigkeiten und menschlichen Geweben nach.
Abb. 1: Forensisch-toxikologische Analysen weisen u.a. Arzneimittelrückstände in Körperflüssigkeiten und menschlichen Geweben nach.
( Bild: www.bilderbox.com )

Zur Klärung von Todesursachen, Drogen- oder Medikamentenmissbrauch und anderen Sachverhalten befasst sich die forensiche Toxikologie mit dem Nachweis von Medikamentenwirkstoffen, Drogen, Giften und deren Abbauprodukten in Körperflüssigkeiten und menschlichen Geweben. Zu den gebräuchlichsten Analysenverfahren zählt dabei auch die GC/MS. Zur Untersuchung von Arzneimitteln in biologischen Proben wird diese in der Regel nach der Isolation des Wirkstoffs oder Metaboliten von der biologischen Matrix durchgeführt. Die meisten Routine-Vorbereitungsmethoden für diese Art von Proben basieren auf Flüssig-Flüssig-Extraktion, Festphasen-Extraktion oder Proteinfällung. Nachteil dieser Methoden: Sie erfordern in aller Regel einen hohen Aufwand an Arbeit und Zeit sowie den Einsatz teils toxischer organischer Lösungsmittel. Die SBSE mit dem Gerstel-Twister wurde entwickelt, um organische Verbindungen aus einer wässrigen Matrix zu extrahieren und zwar quasi ohne Probenvorbereitung.

Bei dem Twister handelt es sich nicht um eine Faser im herkömmlichen Sinne, sondern um ein spezielles, mit Polydimethylsiloxan (PDMS) beschichtetes Rührstäbchen für Magnetrührer. Der Twister extrahiert die Analyten, während er die Probe durchmischt; er wird im Anschluss daran der Probe entnommen, mit destilliertem Wasser von Matrixrückständen befreit, trocken getupft und in einer dafür vorgesehenen Desorptionseinheit (Thermal Desorption Unit/TDU) desorbiert, wobei die Analyten quantitativ auf den angeschlossenen Gaschromatographen überführt werden. Die SBSE ist einfach zu handhaben, kommt ohne umfangreiche Probenvorbereitungsschritte aus und ist(teil-)automatisierbar. Der Twister verfügt über ein sehr viel größeres Polymer- bzw. Sorptionsvolumen (PDMS), das je nach Twister-Format zwischen 20 und 130 µL variiert. Zum Vergleich: Das der SPME-Faser liegt bei 0,5 µL.

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Bei guter Wiederholbarkeit weisen SBSE-Anwendungen in der Regel erheblich niedrigere Nachweisgrenzen (sub-ng/L) auf – vor allem für hydrophobe Verbindungen, da der Extrakt quantitativ auf die GC-Säule überführt wird.

Die SBSE mittels Twister

Wie sich die Wiederfindung eines Analyten mit der SBSE, also dem Twister gestaltet, lässt sich mittels des jeweiligen Ko/w-Wertes abschätzen. Hinter dem Kürzel verbirgt sich der n-Oktanol-Wasser-Verteilungskoeffizient (Ko/w). Der Ko/w ist ein dimensionsloser Wert, der das Verhältnis der Gleichgewichtskonzentration einer Chemikalie in einem Zweiphasensystem bestehend aus n-Oktanol und Wasser bei einer definierten Temperatur angibt. Ein Ko/w > 1 bedeutet, die Substanz löst sich sehr gut in Fett, ein Ko/w < 1 hingegen weist auf eine besonders gute Löslichkeit in Wasser hin. Für den Twister gilt: Hydrophobe gelöste Stoffe mit einem hohen log Ko/w (log Ko/w > 4) lassen sich mit hoher Wiederfindung direkt extrahieren.

Die Wiederfindung gelöster hydrophiler Stoffe (log Ko/w < 4) lässt sich durch einen einfachen Zusatz von NaCl (20 bis 30 Prozent) verbessern. Allerdings führt die Salzaddition zu einer Abnahme der Wiederfindung mancher stärker hydrophober Analyten. Indem man aber die SBSE auf zwei Aliquote derselben Probe anwendet, wobei sich die Extraktionsbedingungen unterscheiden, lässt sich ein breiteres Spektrum chemisch-divergenter Verbindungen nachweisen. Die SBSE von hydrophoben Analyten aus wässrigen Matrices lässt sich auch durch organische Lösemittel wie Methanol optimieren.

Die Nutzung von PDMS-überzogenen Magnet-Rührstäben in Verbindung mit einer modernen Thermodesorptionseinheit und GC/MS verzichtet auf den Gebrauch von Lösungsmitteln für die Extraktion, reduziert die Zeit für die Probenvorbereitung und benötigt nur ein Mindestmaß an zusätzlicher Ausstattung für die Probenvorbereitung. Frühere Bewertungen der SBSE-Methode beinhalteten die Auffindung spezifischer Drogen und Arzneimittel in Urin, Wasser, Speichel und Rinderserum, ebenso wie die Analyse von Pestiziden in Wein, Verunreinigungen in Oberflächenwasser, sowie Fremdstoffen und/oder Konservierungsstoffen in Lebensmitteln [1-5].

In einem Versuchsaufbau wurden verschiedene Wirkstoffe mit unterschiedlichen chemischen Eigenschaften in einer biologischen Probe, namentlich Rindergehirn, mittels des Gerstel-Twisters (SBSE) extrahiert. Die Thermodesorption der Analyten erfolgte in der TDU, ihre Analyse mittels GC/MS. Nach der Analyse einer Probe, deren Anteil an Drogen- und Medikamentenrückständen bekannt war (Positivkontrolle) wurde das hier beschriebene Verfahren auf eine Probe mit unbekannter Medikamenten- und Drogenfracht (Fallprobe) angewendet.

Bei den nachzuweisenden Analyten handelt es sich um: Ibuprofen, Phenobarbital, Metoprolol, Methadon, Cocain, Doxepin, Codein, Diazepam und THC. In der Fallprobe wurden Clomethiazol, Phenprocoumon, Papaverin und Noscapin nachgewiesen.

Probenvorbereitung

Mit dem IKA Ultra Turrax Tube Drive wurden etwa 2 g Hirngewebe (Rind) homogenisiert. Das homogenisierte Gewebe wurde eingewogen und mit Flüssigstandard versetzt. Mit einer 5 mL Eppendorf-Pipette wurden etwa 1 g Gewebe entnommen. Anschließend wurden 5 mL 0,1 M Trizma-Puffer (pH 8,5) gesättigt mit NaCl zugegeben und ein konditionierter PDMS Twister (2 cm Länge, 1 mm Phasenstärke) eingelegt. Die Extraktion auf einer Magnetrührplatte bei 1000 Upm dauerte drei Stunden. Abschließend wurde der Twister mit destilliertem Wasser abgespült, trocken getupft und in ein Desorptionsröhrchen überführt.

Für die Extraktion und Analyse der genannten Wirkstoffe kamen folgende Instrumente zum Einsatz:

Gerstel-Thermal-Desorption-Unit (TDU),

Gerstel-Kalt-Aufgabe-System (KAS) mit LN2-Option,

Gerstel Multi Purpose Sampler (MPS),

GC 6890 Agilent Technologies und

MSD 5975 Agilent Technologies.

Auswertung der Analysenergebnisse

Die Auswertung des Chromatogramms der Positivkontrolle erfolgt mithilfe einer Target-Datenbank in der Agilent MSD Chemstation. Bei der Auswertung der Fallprobe muss nach „unbekannten“ Analyten im Chromatogramm gesucht werden. Dies geschieht mit der Agilent Deconvolution Reporting Software (DRS) die aus der MSD Chemstation gestartet wird. Sie beinhaltet eine Dekonvolution des Chromatogramms durch die AMDIS-Software (Automated Mass Spectral Deconvolution and Identification System) und eine Bibliothekssuche (> 700 Komponenten) mit den dekonvulierten Spektren.

Neben dem Massenspektrum wird auch die Retentionszeit eines Peaks als Identifikationskriterium verwendet. Die Retentionszeit einer jeden Komponente aus der Datenbank ist vor der Analyse mithilfe des Agilent Retention Time Lockings (RTL) auf die in der Datenbank hinterlegten Retentionszeiten angepasst worden. Das dekonvulierte Spektrum jeder mit der AMDIS-Datenbank identifizierten Komponente wird weiterhin zu einer Suche in der NIST-Bibliothek (National Institute of Standards and Technology) verwendet. Außerdem werden die Komponenten mithilfe einer Chemstation Target-Datenbank (gleiche Komponenten wie AMDIS-Datenbank) im Chromatogramm gesucht.

Die Resultate der verschiedenen Bibliothekssuchen werden automatisch in einem Report zusammengefasst. Nach kritischer Durchsicht kann ein endgültiger Report erstellt werden. Für Analyten, deren Nachweis einen Derivatisierungsschritt erforderlich macht, bietet das TDU eine spezielle Online-Derivatisierungsoption.

Literatur

[1] Sandra, P., Baltusssen, E., David, F., Hoffmann, A., Gerstel Anwendungsbericht, 1/2000.

[2] Vendenin, A., Suvorkin, V. und Kachur, E., Gerstel Anwendungsbericht, 7/2004.

[3] Pfannkoch, E., Whitecavage, J., Bramlett, R., Gerstel Anwendungsbericht, 6/2005.

[4] Crifasi, J., Bruder, M., Long, C. und Janssen, K. J. Anal. Tox. Ausgabe 30, Oktober 2006, S 81-92.

[5] Crifasi, J., Bruder, M., Long, C. und Janssen, K. J., Gerstel AppNote 11/2006.

*O. Lerch, S. Sperling, Gerstel GmbH & Co. KG, 45473 Mülheim an der Ruhr

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