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HPLC-MS/MS Gefahr gebannt? Bienenschädigende Neonicotinoide automatisiert bestimmen

Autor / Redakteur: Guido Deußing* / Dr. Ilka Ottleben

Weil sie Bienen schädigen, hat die Europäische Union den Feldeinsatz dreier Schädlingsbekämpfungsmittel der Gruppe der Neonicotinoide untersagt. Analytisch lässt sich das Verbot mittels HPLC-MS/MS überwachen. Die Automatisierung der Probenvorbereitung macht dabei Sinn.

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Abb. 1: Weil sie nicht nur Schadinsekten, sondern auch Nützlinge wie Bienen schädigen, hat die EU den Feldeinsatz von drei Insektiziden aus der Gruppe der Neonicotinoide verboten.
Abb. 1: Weil sie nicht nur Schadinsekten, sondern auch Nützlinge wie Bienen schädigen, hat die EU den Feldeinsatz von drei Insektiziden aus der Gruppe der Neonicotinoide verboten.
(Bild: © robert , © K.THALHOFER- stock.adobe.com; [M]GötzelHorn)

Der Einsatz von Insektiziden in der Landwirtschaft sollte sich eigentlich positiv auf die Ernteerträge auswirken. Was aber, wenn ein Pflanzenschutzmittel nicht nur schädliches, sondern auch nützliches Getier überaus wirksam bekämpft und schädigen kann – Wild- und Honigbienen etwa, die ihrer natürlichen Bestäubungsarbeit wegen einen essenziellen Beitrag für den Ernteerfolg leisten? Aus eben diesem Grund haben die Mitgliedsstaaten der Europäischen Union (EU) den Einsatz bestimmter Neonicotinoide verboten. Es handelt sich dabei um die drei hochwirksamen Insektizide Thiamethoxam, Imidacloprid und Clothianidin, die seit Sommer 2018 nicht mehr auf den Feldern in der EU ausgebracht werden dürfen – weder als Beigabe von Saatgut, noch als Spritzmittel. Weitere Mitglieder der Gruppe der Neonicotinoide stehen derweil bereits unter Beobachtung.

Die drei bekanntermaßen und dem Bann der EU unterworfenen „bienenkillenden“ Wirkstoffe dürfen nicht mehr im Freiland eingesetzt werden, wohl aber noch in Gewächshäusern. Jedes Verbot ist aber nur so wirksam, wie sich seine Einhaltung überprüfen lässt, was erforderlich ist, vor allen Dingen dann, wenn die Anwendung einer Substanz in Ausnahmen und damit auch ihr Eintrag in die Umwelt möglich ist.

Ergänzendes zum Thema
LP-Info: Neonicotinoide – Bann auf Raten

Seit etwa Anfang der 2000er-Jahre stehen etliche insektizide Wirkstoffe im Verdacht, für das Bienensterben mitverantwortlich zu sein, so auch Neonicotinoide. Diese hochwirksamen synthetischen Verbindungen kommen bzw. kamen als Beizmittel, also zur Saatgutbehandlung, für Bodenapplikationen sowie als Spritzmittel für Blattbehandlungen in unterschiedlichen Kulturen zum Einsatz. Bereits 2008 wurde die als besonders kritisch angesehene Saatgutbehandlung von Mais mit Neonicotinoiden in Deutschland verboten. 2013 schränkte die EU-Kommission den Einsatz der drei neonicotinoiden Wirkstoffe Clothianidin, Imidacloprid und Thiamethoxam in Pflanzenschutz ein. 2018 folgte nun das Verbot dieser Wirkstoffe im Freiland. Das Echo auf dieses Verbot ist geteilt. Während Imker und Umweltverbände es begrüßen, bemängelt die Landwirtschaft das Fehlen vergleichbar wirksamer Alternativen und auch manche Wissenschaftler befürchten, dass sich dadurch die Situation der Bienen sogar noch verschlechtern könnte.

Das in Geestland bei Bremerhaven ansässige, auf die Lebensmittel- und Umweltanalytik spezialisierte Auftragslabor Tela, hat den Nachweis von Neonicotinoiden ins Leistungsspektrum aufgenommen. Im Hinblick auf die laborspezifischen Anforderungen orientierte sich das Unternehmen bei der Methodenentwicklung an gängigen Verfahren, wie Dr. Norbert Helle berichtet. Sein Augenmerk habe dabei nicht allein auf der Machbarkeit der Analytik gelegen, schildert der promovierte Chemiker und Geschäftsführer der Tela, sondern auch auf deren Effizienz. Dabei spielte die Geschwindigkeit eine Rolle, also nach welcher Zeit zuverlässig verwertbare Messergebnisse vorliegen, wie auch der Arbeits- und Zeitaufwand, der zu betreiben ist, um Kundenanfragen in einem adäquaten Rahmen zu beantworten. „Das heißt, für uns nimmt die Automatisierung der Analytik eine wichtige Rolle ein, darüber hinaus aber auch die Flexibilität, Methoden bei Bedarf auf weitere Analyten und Fragestellungen ausweiten zu können“, sagt Helle.

Neonicotinoid-Analytik per Quechers-Methode

Flexibilität bedeutet für Tela u.a. auch, Analyten möglichst wahlweise sowohl mittels HPLC-MS/MS als auch mittels der GC-MS/MS bestimmen zu können. Im Fall der Neonicotinoide wurde ein schnelles Analysenverfahren mittels HPLC-MS/MS präferiert. Bei ihrer Vorbereitung griffen die Lebensmitteltechnologien- und Applikationsexpertin Franziska Chmelka und Kollegen auf die Erfahrungen zurück, die sie bereits bei der Analyse eines anderen Insektizids, namentlich Fipronil, gesammelt hatten [1]. Dieses weist Ähnlichkeiten gegenüber den Neonicotinoiden in puncto Toxizität, physikochemischer Wirkung und Verbreitung in der Umwelt auf.

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Bei der Analyse von Fipronil, wie auch bei Pestiziden allgemein, erweist sich die QuEChERS-Methode [2] als Mittel der Wahl. Das Akronym steht für Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe und beschreibt die Eigenschaften des zugrundeliegenden Extraktionsprozesses. Kennzeichen der Quechers-Methode ist der Einsatz einer dispersiven Festphasenextraktion (SPE), die vor allem dazu dient, störende Matrixkomponenten aus der Probe zu entfernen und einen für die anschließende Analyse erforderlichen sauberen Extrakt zu erhalten.

Die Bestimmung von allgemein gesprochen Pestiziden gemäß der klassischen Quechers-Methode aus Lebensmittelproben, gestaltet sich wie folgt: 10 g homogenisierte Probe werden mit 10 mL Acetonitril und dem internen Standard versetzt, mittels Vortex durchmischt und extrahiert. Anschließend werden Magnesiumsulfat und Natriumchlorid zur Probe dosiert. Sie wird erneut geschüttelt und dann zentrifugiert. Die Salzzugabe ermöglicht die Trennung der Acetonitril- und Wasserphase (untere Phase). Ein Aliquot des Überstandes wird entnommen, mit Magnesiumsulfat und einem geeigneten Sorbens versetzt (was den dispersiven Charakter dieser SPE-Methode erklärt), um die mitextrahierten Matrixbestandteile selektiv zu entfernen. Der Extrakt wird geschüttelt und zentrifugiert. Der Überstand kann schließlich zur chromatographischen Untersuchung eingesetzt werden: mittels GC/MS (nach Einengen des Extrakts und Wiederaufnahme in Hexan) oder LC/MS (Extrakt mit Wasser verdünnt).

Automatisierung der Neonicotinoid-Analytik: Ein etwas anderer Ansatz

Chmelka und ihre Kollegen wählten indes eine andere Vorgehensweise. Mit dem Ziel der Automatisierung der Neonicotinoid-Analytik respektive der grundlegenden Extraktionsschritte, setzten sie keine dispersive SPE ein, sondern klassische, kommerziell erhältliche Quechers-SPE-Kartuschen (Macherey-Nagel), deren Sorbensbett aus einer vergleichbaren Mischung der Sorbentien bestand. Diese Kartuschen sind mit Transportadaptern versehen, durch die ihr Einsatz auf einem geeigneten Autosampler möglich wird. Chmelka und ihr Team verwendeten hier einen Multi-Purpose-Sampler (Gerstel-MPS-Workstation).

Zunächst wogen die Applikationsexperten zehn Gramm der Probe (Apfel und Getreide) in ein 50-mL-Zentrifugenglas ein und versetzten sie mit 30 mL Acetonitril sowie dem internen Standard. Der Einsatz deuterierter Analoga biete sich an, ebenso aber eignen sich die Verbindungen Metazachlor-d6 und Carbendazim-d3, die von den Tela-Applikationsexperten verwendet wurden. Anschließend wurde die Probe geschüttelt und zentrifugiert. Aus dem Überstand pipettierten die Forscher 10 mL in ein Probenvial, das sie auf dem MPS platzieren. C

hmelka beschreibt den weiteren, vollständig automatisierten Arbeitsablauf wie folgt: „Zunächst entnimmt der MPS 7 mL Probenlösung und gibt sie auf die erste SPE-Kartusche (Quechers-Mix I, Macherey-Nagel). Das Eluat wird in einem leeren Vial aufgefangen und zwischengelagert, die Kartusche wird verworfen. Sodann entnimmt der MPS 3,5 mL des Eluats des ersten SPE-Schrittes und dosiert sie auf eine zweite SPE-Kartusche (Mix III). Der von Matrix befreite Extrakt wird in einem 10-mL-Vial aufgefangen, der MPS überführt ein Aliquot in ein 2-mL-Vial, das in der angeschlossenen Eindampfstation (Gerstel-mVAP) bis zur Trockene eingedampft wird. Für die Rekonstitution des Rückstands wählt der MPS in Abhängigkeit von der nachfolgenden Analyse das geeignete Laufmittel: Hexan, sofern es sich um eine GC-Messung handelt, oder ein Acetonitril-Wasser-Gemisch, kommt die HPLC zur Anwendung. Für beide Messungen lassen sich Proben auch simultan vorbereiten.“

Die Applikationsexperten des Tela-Auftragslabors führten die Bestimmung auf der HPLC-MS/MS aus. Für die Vermessung der mit den Neonicotinoiden Thiamethoxam, Clothianidin, Imidacloprid, Acetamiprid und Thiacloprid dotierten wässrigen und Lebensmittelproben kam ein Agilent-6470-Triple-Quadrupol-Massensepektrometer zum Einsatz. Die Trennung der Analyten erfolgte auf einer RP-Säule der Marke Bluebird (150 x 3 mm) von Macherey-Nagel, die Elution mit einem Eluentengradienten bestehend aus fünf millimolarer Ameisensäure und Acetonitril (Fluss: 0,2 mL/min; Temperatur: 45 °C).

Überzeugendes Ergebnis

Nach Auswertung der Messresultate kommen Chmelka und Kollegen zu dem Schluss, dass die von ihnen inzwischen in der Laborroutine etablierte Methode zum Nachweis nicht nur verbotener Neonicotinoide durch eine einfache Handhabung und große Effizienz überzeuge: Gleiches gelte auch im Hinblick auf relevante statistische Parameter wie Präzision und Richtigkeit. Die Wiederfindung lag im Schnitt zwischen 85 und 95% und die Reproduzierbarkeit unter 5%. Ihre automatisierte Methode habe in der praktischen Anwendung gezeigt, dass sie in Bezug auf die ausgewählten Analyten eine gute Linearität im Konzentrationsbereich von 0,1 bis 10 ng/mL gewährleisten könne, berichtet Geschäftsführer Helle,: „Die Nachweisgrenzen (LOQ) lagen im Schnitt bei 0,5 µg/kg in Lebensmitteln und 0,05 µg/L in wässrigen Proben und sofern Schritte zur Aufkonzentrierung der Analyten eingebunden werden, lassen sich die Nachweisgrenzen noch weiter senken.“

Referenzen:

[1] www.laborpraxis.vogel.de/fipronil-effizient-und-sicher-per-gc-ms-oder-lc-ms-bestimmen-a-651424/

[2] Michelangelo Anastassiades, Steven J. Lehotay, Darinka Stajnbaher, Frank J. Schenk, Fast Easy Multiresidue Method Employing Acetonitrile Extrac-tion/Partitioning, „Dispersive Solid-Phase Extraction“ for the Determination of Pesticide Residues in Produce, Journal of AOAC International 86 (2003) 412-431

* G. Deußing: Redaktionsbüro Guido Deußing, 41464 Neuss

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