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Strukturaufklärung Genanalyse hilft bei Strukturaufkärung potenzieller Wirkstoffe

Autor / Redakteur: Dominic Janssen und Markus Kalesse* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Die Entwicklung neuer Wirkstoffe aus Naturstoffen setzt deren Strukturaufklärung und Synthese voraus. Dem aus Myxobakterien isolierten Naturstoff Chivosazol konnte erstmals durch die Kombination klassischer Methoden und der Genanalyse des biosynthetischen Genclusters eine Konfiguration zugewiesen werden.

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Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme der F-Actin Organisation in Hautkrebszellen des Typs A431.
Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme der F-Actin Organisation in Hautkrebszellen des Typs A431.
( Archiv: Vogel Business Media )

Die Natur ist ein schier unerschöpflicher Lieferant hoch potenter Wirkstoffe mit einem großem therapeutischem Potenzial für die Menschheit. Die Strukturaufklärung, Synthese und Untersuchung dieser Naturstoffe ist daher ein wichtiger Aspekt der pharmazeutischen Forschung und Entwicklung. Die Synthese ermöglicht neben der Darstellung des Naturstoffs selbst auch die Modifikation der Struktur. Die Analyse dieser modifizierten Derivate gibt Hinweise auf die Struktur-Aktivitätsbeziehungen und trägt damit zu einem besseren Verständnis der Wirkungsweise der Substanz bei. So lassen sich neue Leitstrukturen feststellen und hieraus potentere Pharmazeutika entwickeln. Die Strukturaufklärung und Totalsynthese in der Naturstoffchemie legen hierfür den Grundstein.

Chivosazole – hoch potente Wirkstoffe aus Myxobakterien

Myxobakterien enthalten das größte Genom aller bisher bekannten Bakterien (9,5 bis 10 Mbp) und heben sich durch eine einzigartige Eigenschaft von anderen Bakterien ab: In Nahrungsmangelsituationen besitzen Myxobakterien die Fähigkeit, Fruchtkörper auszubilden. Diese bestehen aus etwa aus 104 bis 106 einzelnen Zellen und sichern den Fortbestand des Organismus [1]. Dabei produzieren die Myxobakterien eine Vielzahl biologisch aktiver Sekundärmetabolite der verschiedensten chemischen Klassen. So kommen Makrolactone und -lactame, Polyether, Polyensegmente, Alkaloide, aromatische Teilstücke, aber auch klassische Makrolide mit einem Glykosidrest vor.

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Eine der isolierten Substanzklassen bilden die Chivosazole, die sich aus sieben Makroliden zusammensetzen (Abb. 3). Die Basisstruktur aller Chivosazole bildet ein 31-gliedriges Makrolacton, welches mehrere Polyensegmente im Ring und eine Seitenkette am Kohlenstoffatom C30 aufweist. Charakteristisch für die Chivosazole ist die Oxazol-Substruktur im Makrocyclus. Des Weiteren sind alle Vertreter dieser Substanzklasse außer Chivosazol F (7) an C11 glykosyliert [2].

Chivosazole weisen eine hohe antibiotische Aktivität auf und sind darüber hinaus hochgradig cytotoxisch gegen Säugerzellen (IC50 9 ng/mL). Sie zerstören dabei das Actin-Cytoskelett der eukaryonten Zellen. Aufgrund dieser Eigenschaften ist die Substanzklasse von potenziellem Nutzen für die pharmazeutische Industrie (Abb. 1) [3].

Die klassischen Methoden der Konfigurationszuweisung

Im Rahmen der Strukturaufklärung von Naturstoffen eröffnet die Röntgenstrukturanalyse eine effiziente und häufig angewandte Methode zur Zuweisung der relativen Konfiguration. Jedoch konnte diese Methode hier nicht angewendet werden, da keine Kristalle von Chivosazol A (1) verfügbar waren. Um die Konfiguration der Stereozentren in Chivosazol A aufzuklären, wurden daher klassische, chemische Methoden der Strukturaufklärung genutzt. Zunächst sollte die relative Konfiguration des 1,3-Diols an den Kohlenstoffen C32 und C34 festgelegt werden. Dafür bot sich die Methode nach Rychnovsky und Evans an, bei der das Acetonid des zu untersuchenden Diols gebildet wird (Abb. 2). Die Analyse des 13C-NMR-Spektrums des Acetonids liefert die Information, um eine syn- oder anti-Relation der Stereozentren im Diol festzustellen. Die 13C-NMR-Signale des Acetonids bei chemischen Verschiebungen von d = 24,8, 25,2 und 101,8 ppm weisen auf eine 1,3-anti-Diol-Anordnung an C32 und C34 hin [4].

Eine weitere Möglichkeit der Strukturaufklärung ist die Fragmentierung der Naturstoffe, um anschließend die Konfiguration der isolierten Fragmente durch Synthese und Vergleich zu bestimmen. Chivosazol A wurde dazu einer Ozonolyse unterzogen, bei der das C28-C35-Fragment (9) isoliert werden konnte (Abb. 4).

Die relative Konfiguration des Fragments 9 konnte durch NOESY-Experimente bestimmt werden. Die enantioselektive Synthese des Fragments und der Vergleich mit dem isolierten Fragment bestätigte die relative Konfiguration und lieferte darüber hinaus die absolute Konfiguration der Kohlenstoffe C29, C30, C31, C32 und C34.

Die Konfiguration der restlichen fünf Chiralitätszentren in Chivosazol A wurde durch eine Strukturanalyse mithilfe von NMR-Daten und Molecular-Modelling bestimmt [5]. Die Konformationsanalyse erfolgte mittels Monte-Carlo-Suche mit der Software Macromodel (Schrödinger, Version 8.0). Auf diese Weise erhält man die Konformation mit der niedrigsten Energie im Einklang mit der aus den NMR-Experimenten ermittelten Struktur. Aufgrund der hohen Flexibilität der Seitenkette konnte mit dieser Methode nur die relative Konfiguration der sieben Stereozentren innerhalb des Makrolactons bestimmt werden.

Die Betrachtungen führten in Kombination mit den bisherigen Konfigurationszuweisungen zur absoluten Konfiguration von Chivosazol A (1) (Abb. 6).

Die zugrundeliegenden Methoden sind jedoch limitiert. So sind die spektroskopischen Methoden von der Konformation des Naturstoffs abhängig, liefern bisweilen keine eindeutigen Ergebnisse und geben so oftmals keinen Aufschluss über die Konfiguration. Die klassischen chemischen Methoden zur Strukturaufklärung dagegen erfordern eine gewisse Substanzmenge des Sekundärmetaboliten, die häufig nicht zur Verfügung steht. Daher ist eine Methode zur Strukturaufklärung, die unabhängig von Konformation, spektroskopischen Ergebnissen, Abundanz und Reaktivität des Naturstoffes ist, von großem Vorteil für die Konfigurationsbestimmung.

Genanalyse – die neue Disziplin in der Strukturaufklärung

Eine unabhängige Methode der Strukturaufklärung von Polyketiden bietet die Analyse ihres biosynthetischen Genclusters. Der biosynthetische Gencluster von Chivosazol A (1) enthält sowohl mehrere Polyketidsynthase-Gene als auch ein Hybrid aus Polyketidsynthase- und nicht-ribosomalem Peptidsynthetase-Gen (PKS und NRPS) [6]. Nach einer von Reid und Caffrey entwickelten Methode lässt sich aus der Aminosäuresequenz in den Ketoreduktasen (KR) der PKS auf die absolute Konfiguration der Sauerstoffsubstituenten schließen [7]. So führt die Anwesenheit eines Aspartat-Restes in der Zentralregion der KR zu der D-Konfiguration des zugehörigen Alkohols. Die Abwesenheit dieses Aspartat-Restes zeigt hingegen die Bildung der L-Konfiguration an.

Diese Vorgehensweise liefert die absolute Konfiguration aller Sauerstoffsubstituenten im Naturstoff, sodass die Zentren C11, C20, C22, C30, C32 und C34 bestimmt werden konnten (Abb. 6). Die mit dieser Methode bestimmten Konfigurationen stimmen mit den bereits erhaltenen Ergebnissen überein. Die Genanalyse bietet somit einen von den klassischen Methoden unabhängigen Ansatz zur Strukturaufklärung von Polyketiden. So wurde erstmalig am Beispiel von Chivosazol A durch die Kombination von klassischer Strukturzuweisung und Genanalyse die absolute Konfiguration eines Naturstoffs aufgeklärt [8]. Dabei basiert die Analyse für einige Bereiche des Moleküls auf den drei unabhängigen Vorgehensweisen, chemischer Abbau und Synthese, Analyse der NMR-Daten in Kombination mit Rechner-gestützter Konformationsanalyse und Zuweisung der Aminosäure-Sequenz der Ketoreduktasen. Alle drei Vorgehensweisen gelangen unabhängig voneinander zur selben Konfigurationszuweisung. In dem hier vorliegenden Fall konnte die absolute Konfiguration von Chivosazol A (1) nur durch die Kombination aller drei Ansätze verlässlich bestimmt werden (Abb. 6).

Literatur

[1] H. Reichenbach, J. Indust. Microbiol. Biotech. 2001, 27, 149-156.

[2] R. Janssen, H. Irschik, H. Reichenbach, G. Höfle, Liebigs Ann. 1997, 1725-1732.

[3] Aufnahmen Dr. Florenz Sasse, Chemische Biologie, HZI, Braunschweig.

[4] S. D. Rychnovsky, B. N. Rogers, T. I. Richardson, Acc. Chem. Res. 1998, 31, 9-17; D. A. Evans, D. L. Rieger, J. R. Gage, Tetrahedron Lett. 1990 ,31, 7099-7100.

[5] F. Mohamadi, N. G. J. Richards, W. C. Guida, R. Liskamp, M. Lipton, C. Caufield, G. Chang, T. Hendrickson, W. C. Still, J. Comput. Chem. 1990, 11, 440-467.

[6] O. Perlova, K. Gerth, O. Kaiser, A. Hans, R. Müller, J. Biotechnol 2006, 121, 174-191.

[7] R. Reid, M. Piagentini, E. Rodriguez, G. Ashley, N. Viswanathan, J. Carney, D. V. Santi, C. R. Hutchinson, R. McDaniel, Bio-chemistry 2003, 42, 72-79; P. Caffrey, ChemBioChem 2003, 4, 654-657.

[8] D. Janssen, D. Albert, R. Jansen, R. Müller, M. Kalesse, Angew. Chem. 2007, 119, 4985-4988, Angew. Chem. Int. Ed. 2007, 46, 4898-4901.

*Leibniz Universität Hannover, Institut für Organische Chemie, 30167 Hannover

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