Automatisierte Zelltransfektion und Reportergen-Assay

Genaue und reproduzierbare Messungen der Reporteraktivität

Bereitgestellt von: Beckman Coulter GmbH

Genaue und reproduzierbare Messungen der Reporteraktivität

Reportergen-Assays verbessern das Verständnis der Genregulation und Signaltransduktion in vitro und in vivo. Wie aber werden Reportergen-Assays mit zwei Biomek NXP-Workstations automatisiert, um genaue Messungen der Reporteraktivität zu liefern?

Reportergen-Assays werden verwendet, um die Genexpression und -regulation zu untersuchen. Die häufigsten Anwendungen umfassen die Untersuchung cis-regulatorischer Sequenzen wie Enhancer und Promotoren, funktioneller Analyse des Promoters von Single-Nukleotidpolymorphismen und die Untersuchung von Signalwegen und Wirkstoffforschung. Chemilumineszenz-Reporter übertreffen oftmals fluoreszierende, kolorimetrische oder radioaktive Reporter aufgrund ihrer inhärenten Empfindlichkeit, großen dynamischen Bereiche und wegen des einfachen Set-Ups.
 
In einem typischen Assay werden Zellen mit einem Vektor transfiziert, welcher die interessierende Sequenz enthält, die upstream auf einen Lumineszenzreporter kloniert wurden. In transienten Transfektionsexperimenten wird häufig eine interne Kontrolle mit konstitutiver Expression hinzugefügt. Dieses System ist bekannt als der Dual Luciferase Reporter (DLR)-Assay. Die Aktivitäten der Luciferasen von Firefly und Renilla werden nacheinander aus einer einzigen Probe gemessen, basierend auf den unterschiedlichen Substratspezifitäten der beiden Luciferasen, was eine bequeme Möglichkeit darstellt, sowohl Test- als auch Kontrollreporter-Aktivitäten zu messen.
 
Beckman Coulter hat versucht, einen Reportergen-Assay basierend auf dem DLR-System und mit folgenden Anforderungen zu entwickeln:

  • Der Test sollte vollständig automatisiert sein (außer für die Zellkultur).
  • Die Genexpression sollte für Expressionsgrade über mehrere Größenordnungen genau und reproduzierbar gemessen werden.
  • Um Kosteneffektivität zu gewährleisten, sollten Reagenzienvolumina minimiert werden, ohne die Datenqualität zu beeinträchtigen. 
Das englischsprachige Whitepaper stellt ein automatisiertes Protokoll vor, das diese hohen Anforderungen durch den Einsatz von zwei Biomek NXP Workstations für die transiente Transfektion und für den DLR-Assay von synthetischen Promotorvarianten erfüllt. Des Weiteren zeigen wir, dass der Einsatz von Automatisierung, neben der Erhöhung des Durchsatzes, zu einer reduzierten Variabilität von Messungen über einen Dynamikbereich von bis zu fünf Größenordnungen führt.

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Publiziert: 01.11.18 | Beckman Coulter GmbH

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