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Isotopenanalyse Gesicherte Herkunft durch Analyse stabiler Isotope

Autor / Redakteur: Hilmar Förstel* und Karl Gebhardt** / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Da ein Wald nur langsam wächst, kann der Einsatz von ungeeignetem forstlichen Saatgut erst nach vielen Jahren erkannt werden. Eine Überprüfung des eingesetzten Materials zu einem frühen Zeitpunkt ist also wünschenswert. Lesen Sie, wie die stabile Isotopenanalyse bei dieser Kontrolle hilft.

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1 Ernte von Bucheckern mithilfe von ausgelegten Netzen in einem zugelassenen Bestand. Bild: Nordwestdeutsche Forstliche Versuchsanstalt
1 Ernte von Bucheckern mithilfe von ausgelegten Netzen in einem zugelassenen Bestand. Bild: Nordwestdeutsche Forstliche Versuchsanstalt
( Archiv: Vogel Business Media )

Das Forstvermehrungsgut-Gesetz FoVG schreibt vor, dass forstliches Vermehrungsgut nur aus „geprüften“ Beständen zur Aufforstung eingesetzt werden darf. Nicht nur rein wirtschaftliche, sondern auch ökologische Gesichtspunkte sprechen für den Einsatz angepasster oder einheimischer Pflanzen. Aus billigem Saatgut wachsen zwar zunächst auch neue Pflanzen, doch deren Erfolg oder Misserfolg kann man erst nach vielen Jahren erkennen. Dabei ist es dem Saatgut äußerlich nicht anzusehen, woher es stammt und ob die angegebene Herkunft richtig ist.

Die Gewinnung von Forstsaatgut ist keineswegs einfach: Für Bucheckern müssen z.B. großflächig Netze ausgelegt werden (s. Abb. 1) und auf Nadelbäumen müssen Pflücker bis in die Baumspitzen klettern. Daher liegt es nahe, Gewinne durch die Einfuhr von billig geerntetem, niedrigpreisigem Saatgut aus anderen Regionen, zu erzielen. Dieses Saatgut genügt allerdings oftmals nicht den Anforderungen.

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Bei der Analyse dieses Saatguts haben sich zwar genetische Kontrollmethoden als wichtiges Arbeitsmittel bewährt, doch sind Populationen oftmals schwer abzugrenzen und die Gene werden durch den jährlichen Pollenflug immer wieder neu verteilt. Daher ist eine Absicherung durch Referenzproben von Jahr zu Jahr erforderlich.

So wie die Genetik eine Eigenschaft ausnutzt, die dem Material von Natur aus mitgegeben wird, so nutzt die Analyse der stabil-isotopen Zusammensetzung auch eine solche unverfälschbare Eigenschaft aus. Der Unterschied zwischen beiden Methoden besteht darin, dass der genetische Fingerabdruck unabhängig vom Wachs-tumsort erhalten bleibt, während der isotope Fingerabdruck den Ort des Wachstums widerspiegelt, da die Pflanze ihre Substanz aus Elementen der unmittelbaren Umgebung aufbaut.

Die wichtigsten Elemente, die die Biomasse bilden, bestehen aus mindestens zwei stabilen Isotopen, wobei das leichtere Isotop den Hauptanteil bildet (s. Tab. 1)

So ergibt sich das markanteste geografische Muster daraus, dass 98 Prozent des freien Wassers auf der Erdoberfläche im Ozean vorliegen, aber nur ein wesentlich geringerer Anteil über die Luftmassen als Niederschlag über die Kontinente verteilt wird. Daraus resultiert derzeit ein gut bekanntes und konstantes Muster, das als Grundlage für Herkunftsanalysen mithilfe der Isotope des Wasserstoffs und Sauerstoffs dient. Für den Kohlenstoff kommen außer einem grundsätzlichen Effekt der Photosynthese in der praktischen Anwendung aber nur weniger ausgeprägte klimatische Einflüsse hinzu. Aussagekräftiger dagegen sind die Prägungen durch den Boden, auf dem der Bestand stockt, also die Quellen für den Stickstoff und für den Schwefel.

Schnelle und präzise Analytik

Um in der Praxis die Frage nach der Herkunft des Saatguts schnell und preisgünstig beantworten zu können, muss die Methode die Unterschiede in der natürlichen Variation im Material erfassen können und gut reproduzierbar sein. Dazu bietet sich die Stabilisotopen-Verhältnismessung (isotope ratio mass spectrometry IRMS) in der Open-split-Technik an, bei der die Probenaufbereitung zu einfachen Messgasen von einem Elementanalysator oder einem Pyrolyseofen übernommen wird. Die erreichte Reproduzierbarkeit reicht mit Hinblick auf die natürliche Variation im Material selbst aus.

Der einzige Nachteil dieser Kombination besteht darin, dass nur eine geringe Probenmenge im mg-Bereich eingesetzt werden kann. Daher muss das Probenmaterial hinreichend zerkleinert werden, um eine repräsentative Probe zu erhalten. Allerdings muss auch darauf hingewiesen werden, dass die Probe aus dem gesamten Erntegut eines Bestandes zu entnehmen ist, da im Material und im Bestand Streuungen beobachtet wurden.

Für Forstsaatgut kann sein Wasseranteil nicht für die Beurteilung herangezogen werden. Für trockenes Material sind die 13C/12C und 15N/14N-Verhältnisse diejenigen Messparameter, die am einfachsten zu bestimmen sind. Im Elementanalysator wird das Material zunächst bei 1000 ºC unter Zugabe von Sauerstoff verbrannt, wobei CO2 und NOx entsteht. Danach werden in einer mit Kupfer gefüllten Säule bei 600 ºC die Stickoxide zu elementarem Stickstoff reduziert. Schwefel wird in ähnlicher Weise zu Schwefeldioxid oxidiert. Organisch gebundener Sauerstoff und Wasserstoff werden pyrolytisch bei Temperaturen um 1500 °C im Helium-Trägergasstrom zu Kohlenmonoxid und Wasserstoff umgesetzt, wobei dieser Prozess eine vollkommene Abwesenheit von Sauerstoff erfordert. Dies wird durch ein neu entwickeltes Reaktionsrohr aus einem spezifisch gesintertem Siliciumcarbid erreicht, das selbst keinen Sauerstoff enthält und auch keinen aus der Luft durchlässt.

In der Abbildung 2 wird die Grundausstattung zur Messung des 13C/12C- und 15N/14N-Verhältnisses dargestellt. Die Anordnung zur Messung des 34S/32S ist analog. Allerdings ist dabei darauf zu achten, dass keine kalten Stellen im Messsystem die Auskondensation von Wasserdampf und damit die Bildung schwefeliger Säure fördern. Das Pyrolysesystem erfordert Öfen mit hoher Temperatur und einer guten Abdichtung nach außen.

Zur Umsetzung wird das Material in kleine Kapseln aus Zinn oder Silber eingewogen und darin verschlossen. Für die Messung des 13C/12C und 15N/14N-Verhältnisses dient der an den Ausgang der GC-Trennung angeschlossene Wärmeleitfähigkeitsdetektor noch dazu, den Gehalt an Kohlenstoff und Stickstoff in der Probe zu bestimmen. Die hohe Reproduzierbarkeit wird dadurch erreicht, dass einmal in jeden Messlauf regelmäßig Proben bekannter Zusammensetzung eingefügt werden, das Messgas jeder Probe direkt mit einem laborinternen Gas verglichen wird und internationale Bezugswerte, die Primary Reference Materials PRM sowohl von der Internationalen Atomenergiebehörde in Wien IAEA als auch vom National Institute of Standards and Technology Gaiherburg USA NIST verteilt werden. Abweichungen von diesen Standards werden, da die Angaben auf einer Atom-%-Skala als kleine Zahlen unübersichtlich wären, als Abweichungen vom internationalen PRM in ‰ angegeben (Delta-Wert):

Der δ-Wert (Delta-Wert) in ‰ errechnet sich nach der Formel: s. Abbildung in Bildergalerie

Der isotope Fingerabdruck

Stabilisotopen prägen das Saat- und Pflanzgut unabhängig von der genetischen Abstammung entsprechend der am Ernteort gegebenen Stabilisotopenverhältnisse. Da das Saatgut die isotope Zusammensetzung seines Ursprungs unverfälschbar widerspiegelt, wird daher auch von einem „isotopen Fingerabdruck“ gesprochen.

Untersucht wurden Arten, die dem FoVG unterliegen: Buche, Stiel- und Traubeneiche, Douglasie, Fichte, Tanne, Hybridlärche, Winterlinde, Roterle, Vogelkirsche, Berg- und Spitzahorn sowie Pappelhybriden. Die Analysenwerte erwiesen sich als abhängig von der Art, den untersuchten Gewebeteilen (Samen, Knospen, Rinde), dem Reifejahr und dem Ernteort. Mithilfe einer multivarianten Betrachtung der Deltawerte der verschiedenen Elemente sowie C- und N-Gehalte der selben Pflanzenteile und des selben Reifejahres war es möglich, die geografische Herkunft gegeneinander abzugrenzen [5].

Abhängig von Art und Standort zeigen die Stabilisotopen signifikante Differenzen zwischen verschiedenen Herkunftsorten, wobei es von Vorteil ist, dass die stabilen Isotope jedes Elementes anders fraktioniert werden. So konnte für Bucheckern aus fünf hessischen Forstämtern gezeigt werden, dass eingelagertes Saatgut auch in kleinen Teilmengen (1 kg) anhand der Analysenwerte den Ausgangsbeständen sicher zugeordnet werden kann, da schon das Verhältnis von 15N/14N zwischen den Beständen signifikant variiert (s. Abb. 3).

Bei der Zuordnung von Einzelbaumabsaaten verursachen die Unterschiede innerhalb eines Bestandes eine größere Streuung der Analysenwerte und erhöhen die Fehlerrate. Von 127 zufällig beernteten Saatgutpartien deutscher Roterlen-Herkünfte (aus 19 Orten und 16 Reifejahren) konnten mithilfe der Diskriminanzanalyse anhand aller Stabilisotopenwerte und Elementgehalte (C, N) 84 Prozent der angegebenen Herkunft zugeordnet werden. Wie am Beispiel von außerhessischen Buchen-Saatgutpartien gezeigt, können fallweise auch falsch deklarierte Saatgutpartien allein anhand ihrer Analysenwerte als nichtzugehörig identifiziert werden [3]. Auch Saatgut einzelner Bäume von Bergahorn, Fichte und Weißtanne war aufgrund signifikanter Unterschiede des D/H-, 18O/16O-, 14N/15N-, 13C/12C- und 34S/32S-Verhältnis mithilfe der Diskriminanzanalyse bestimmten Erntebeständen zuzuordnen [4].

Die Ergebnisse der von der Firma Agroisolab durchgeführten Hauptkomponentenanalyse (s. Abb. 4) zeigen eine gute Trennung der Saatgutbestände nach einer rechnerischen Glättung der Mittelwerte.

Ausblick

Derzeit ist die Zuordnung zu einem bestimmten Bestand noch davon abhängig, dass Referenzmaterial als Rückstellprobe vorliegt. Wünschenswert wäre es, wenn einzelne Pflanzen-Organe, wie Knospen oder Äste für eine solche Zuordnung ausreichen würden. Hinweise auf eine Korrelation zwischen Samen und Knospen wurden bereits gefunden.

In Zukunft wird die Stabilisotopen-Methode nicht nur auf die Bestätigung oder Ablehnung der Herkunft aus einem bestimmten Bestand anwendbar sein, sondern es wird auch möglich sein, die Herkunft von Saatgut geografisch nach Regionen zuzuordnen. Die stabil-isotope Zusammensetzung des Saatgutes wird von den Verhältnissen am Standort geprägt und ist unabhängig von der genetischen Disposition. Damit ergänzen sich die genetische Methode und die Stabilisotopen-Methode, indem die eine die Abstammung und die andere den Standort erkennen lässt.

Literatur

[1] H. Förstel (1978): The natural fingerprint of stable isotopes – use of IRMS to test food authenticity. Analytical and Bioanalytical Biochemistry 388:541-544.

[2] H. Förstel (2008): Die natürliche Variation und die Messung der stabilen Isotope als Kontrollmethode. In: „Herkunftskontrolle mit Stabilisotopen und genetischen Methoden.“ Ed. K. Gebhardt, ISBN 978-3-00-024808-5, p. 16-37

[3] K. Gebhardt (2008): Unterscheidung von Saatgutpartien der Buche und Roterle anhand der Stabilisotopen-Signaturen (13C/15N) und Elementgehalte von Kohlenstoff und Stickstoff. In: „Herkunftskontrolle mit Stabilisotopen und genetischen Methoden.“ Ed. K. Gebhardt, ISBN 978-3-00-024808-5, p. 51-66

[4] K. Gebhardt; M. Konnert; H. Förstel (2008): Nachweis der Herkunft von Saatgutpartien des Bergahorns, der Fichte und der Weißtanne mit Hilfe stabiler Isotopen. In: „Herkunftskontrolle mit Stabilisotopen und genetischen Methoden.“ Ed. K. Gebhardt, ISBN 978-3-00-024808-5, p. 101-110

[5] K. Gebhardt; E. Schönfelder (2008): Differentiation of seedlots of wild cherry by the analysis of stable isotopes (13C, 15N). Austrian Journal of Forest Science 125: 121-134

[6] IAEA International Atomic Energy Agency (ed.) (1995): Reference and intercomparison materials for stable isotopes of light elements. IAEA-TECDOC-825, Vienna.

[7] M. Konnert; E. Cremer; H. Förstel (2008): Umsetzung und Verbesserung des ZüF-Verfahrens mit Hilfe genetischer Analysen und der Stabilisotopen-Methode am Beispiel von Bergahorn, Fichte und Weißtanne. In: „Herkunftskontrolle mit Stabilisotopen und genetischen Methoden.“ Ed. K. Gebhardt, ISBN 978-3-00-024808-5, p. 85-101

*Prof. Dr. H. Förstel, Agroisolab GmbH, 52428 Jülich,

**Dr. K. Gebhardt, Nordwestdeutsche Forstliche Versuchsanstalt, 34346 Hann. Münden

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