English China
Suchen

Gradienten effizienter nutzen

Gradientenvolumen-Konzept optimiert die Flüssigchromatographie

Seite: 2/2

Firmen zum Thema

Abgestimmte Vorgehensweise bringt optimale Ergebnisse

Besonders effektiv ist die Methodenbeschleunigung, wenn in abgestimmter Weise Säulendimensionen, Teilchengröße der stationären Phase, Flussraten und Gradientenprofile optimiert werden. Ein praktisches Beispiel soll dies verdeutlichen: Ausgangssituation ist eine 250 mm lange Trennsäule, gepackt mit 5-µm-Phasenmaterial und betrieben mit einem Gradientenprogramm, dessen linear ansteigendes Hauptsegment 10 Minuten dauert.

Den grundlegenden Regeln (Mehr zu diesen Regeln finden Sie in unserem Übersichtsartikel.) folgend, soll die Methode von einem Transfer auf eine kürzere Säule mit effizienteren 3-µm-Partikeln profitieren. Entsprechend der Verringerung des Teilchendurchmessers dp von 5 µm auf 3 µm, wird die Säule um diesen Faktor auf 150 mm verkürzt. Gemäß der van-Deemter-Theorie muss sich die mobile Phase um diesen Faktor schneller durch die Säule bewegen. Um Lösemittel einzusparen und hohe Flussraten zu vermeiden, wurde aber gleichzeitig der Säulendurchmesser von 4,6 mm auf 2,1 mm reduziert. Wie muss nun das Gradientenprogramm angepasst werden, um dem Gradientenvolumen-Konzept zu entsprechen?

Bildergalerie

Die neue Zielflussrate wird aus der Ausgangsflussrate und den Verhältnissen der Teilchen- und Säulendurchmesser nach folgender Formel bestimmt:

(Bild: Thermo Fisher Scientific)

Sie beträgt in diesem Fall 0,5 ml/min und durch die wesentlich engere Säule wird bei ungefähr einem Drittel der ursprünglichen Flussrate eine 67% höhere lineare Strömungsgeschwindigkeit u in der Säule erzeugt (sie steigt von 2,2 mm/s auf 3,7 mm/s).

Die Säulenvolumina VC werden über das Volumen eines Zylinders mit 4,6 mm ID und 250 mm Länge bzw. 2,1 mm ID und 150 mm Länge berechnet. Das Säulenvolumen wird demnach von 4,15 ml auf 0,52 ml gesenkt. Damit stehen alle Angaben zur Verfügung, die zur Definition des neuen Gradientenprogramms gebraucht werden. Einsetzen in die in Abbildung 1 gezeigte Formel ergibt eine Segmentdauer von 3,6 Minuten anstatt der früheren 10 Minuten. Anschließend transferiert man die übrigen Gradientensegmente (Spülen der Säule und Äquilibrierung) um den gleichen Faktor.

Moderne Chromatographie-Datensysteme (CDS) wie das Thermo Scientific Chromeleon 7.2 CDS integrieren entsprechende Umrechnungsassistenten bereits in den Methodeneditor und erlauben damit ein schnelles, komfortables und fehlerfreies Übertragen und Beschleunigen von LC-Trennungen. Es finden sich aber auch Konversionsrechner im Internet.

Wie „steil“ sollte der Gradient sein?

Gibt es Empfehlungen, welches Gradientenvolumen VG geeignet ist, wenn eine neue Methode entwickelt wird? Es gibt solche Anhaltspunkte, abhängig davon, welchen Zweck die neue Methode verfolgen soll, wobei drei Fälle unterschieden werden können. Dabei gilt jeweils das Verhältnis zum eingesetzten Säulenvolumen VC als Maßstab.

Ein kleines Gradientenvolumen (VG ≤ 5 x VC) führt zu schmalen Peaks, damit zu einer vergleichsweise hohen Konzentra­tion an Analyt im eluierten Peak, also gutem Signal-Rauschen-Verhältnis im Detektor, jedoch relativ geringer Auflösung. Dies eignet sich gut zur Spurenanalytik bei moderat komplexen Proben. Ein mittelgroßes Gradientenvolumen VG von etwa 6 bis 15 Säulenvolumina VC stellt einen guten Kompromiss zwischen Auflösung und Analysendauer dar. In diesem Bereich sollte die Entwicklung von üblichen Methoden gestartet werden.

Ein sehr großes Gradientenvolumen (VG > 15 x VC) wird für die komplexe Multikomponentenanalyse empfohlen. Es erzeugt eine hohe Peakkapazität bei relativ langer Analysendauer. Einen Wert von VG = 30 x VC zu überschreiten, bringt jedoch kaum noch einen Gewinn an Auflösung.

Abschließend ein Beispiel, das die Auswirkung das Gradientenvolumens auf die Gestalt eines Chromatogrammes verdeutlicht. In Abbildung 2 wurde das VG/VC-Verhältnis durch Ändern von tG und/oder F bei konstanter Säule variiert. Es ist offensichtlich, dass mit sinkendem VG/VC

  • Peaks schmäler werden und die Peakhöhe steigt,
  • die allgemeine Auflösung sinkt, aber ebenso die Analysenzeit sowie
  • Selektivitäten zwischen bestimmten Peakpaaren sich verändern können.

Der Vergleich von a) und b) aus Abbildung 2 zeigt: Solange VG/VC bei Werten oberhalb von 5 liegt, ist die Gesamtauflösung relativ robust, ein kleineres VG erlaubt die Trennung aber deutlich zu beschleunigen. Änderungen der relativen Retention lassen sich an der Lage und Auflösung der kleineren Peaks (Verunreinigungen) erkennen. Methode c) erlaubt noch immer die Hauptkomponenten aufzulösen und dies bei erheblicher Einsparung von Zeit und Lösemittel, Verunreinigungen können hier jedoch nicht mehr aufgelöst werden.

* Dr. F. Steiner, Dr. M. M. Martin: Thermo Fisher Scientific, 82110 Germering

(ID:44363082)