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Gradienten effizienter nutzen Gradientenvolumen-Konzept optimiert die Flüssigchromatographie

Autor / Redakteur: Frank Steiner, Markus M. Martin* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Die Reproduzierbarkeit und Genauigkeit einer HPLC-Trennung hängen in hohem Maße von der Zusammensetzung des Eluenten bzw. jeweiligen Lösungsmittelgemisches ab. Lesen Sie in unserer HPLC-Serie, wie Sie mithilfe eines Gradientenvolumen-Konzeptes Ihre Trennung optimieren.

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Konkretes Beispiel für die Anpassung aller Methodenparameter bei der Übertragung einer Gradientenmethode auf eine kleinere und effizientere Säule (der Link www.separatedbyexperience.com/products/GradientMethod.aspx führt zu einem Internet-basierten Methodenkonversions-Rechner).
Konkretes Beispiel für die Anpassung aller Methodenparameter bei der Übertragung einer Gradientenmethode auf eine kleinere und effizientere Säule (der Link www.separatedbyexperience.com/products/GradientMethod.aspx führt zu einem Internet-basierten Methodenkonversions-Rechner).
(Bild: Thermo Fisher Scientific)

Im Unterschied zu isokratischen Trennungen spielt bei Gradientenmethoden in der Flüssigchromatographie neben der Flussrate auch die Änderung der Laufmittelzusammensetzung über die Zeit eine Rolle. Eine reine Flusserhöhung wird die Analyse im Gradienten nur unerheblich beschleunigen, während es bei isokratischen Methoden dabei eine strenge Proportionalität gibt. Weil eine Substanz erst beim Erreichen einer bestimmten Eluentenstärke im Gradienten merklich auf der Säule bewegt wird, ist es für die Analysendauer kaum von Belang, mit welcher Geschwindigkeit das Laufmittel transportiert wird. So wie die entscheidende Elutionszusammensetzung erst zu einer bestimmten Zeit von der Gradienten-Pumpe gemischt und zur Säule gefördert wird, wird die entsprechende Substanz nicht vor diesem Zeitpunkt durch die Säule wandern, auch nicht bei höherer Flussrate. Deshalb müssen Flussrate und Gradientenprogramm stets abgestimmt verändert werden.

Eine Verkürzung der Säulenlänge unter Erhalt der Flussrate führt bei isokratischen Trennungen zu einer Beschleunigung der Analyse, genau um den Faktor, mit dem die neue Säule kürzer gewählt wurde. Wird bei einer Gradientenmethode auf eine kürzere Säule gewechselt, muss stets die Steigung des Gradienten um den gleichen Faktor erhöht werden, wie die Säule verkürzt wurde.

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Gradientenvolumen genauer betrachtet

Zum Übertragen von Gradiententrennungen auf andere Flussraten oder Säulen­dimensionen hilft die Beachtung des so genannten Gradientenvolumen-Konzepts. Wie ist dieses definiert? Das Gradientenvolumen VG ist das gesamte Volumen an mobiler Phase, das während der Gradientenphase durch die Säule gepumpt wird. Es entspricht dem Produkt aus der Flussrate F und der Dauer des Gradienten tG (bzw. eines Gradientensegmentes bei Stufen- oder Mehrsegmentgradienten).

Die erste Regel im Sinne des Gradientenvolumen-Konzeptes besagt, dass bei Veränderung der Flussrate auf einer gegebenen Säule stets das Gradientenvolumen konstant gehalten werden muss.

(Bild: Thermo Fisher Scientific)

Es sei kurz die Frage beleuchtet, wie relevant Flussraten bei Gradientenmethoden im Hinblick auf die Qualität der Trennung sind, also die chromatographische Auflösung in Abhängigkeit von der Flussrate. Grundsätzlich gibt es auch für Gradiententrennungen eine optimale Flussrate. Sie entspricht dem in isokratischen Experimenten ermittelten Minimum der van-Deemter-Kurve, wenngleich Gradientenmethoden keine Bestimmung von Bodenzahlen oder Bodenhöhen erlauben. Sollte bei Gradientenmethoden abweichend von der optimalen Flussrate gearbeitet werden, ist der negative Effekt auf die Trennung wesentlich geringer ausgeprägt. Dies liegt daran, dass Substanzzonen beim Wandern durch die Säule aufgrund der ständigen Erhöhung der Elutionskraft permanent fokussiert werden. Dieser Effekt wirkt der üblichen Bandenverbreiterung entgegen und gestaltet die Auflösung bei Flussratenänderung in Gradientenmethoden deutlich robuster als bei isokratischer Arbeitsweise. Unter strengem Einhalten des Gradientenvolumen-Konzeptes sei der Anwender also auch ermutigt, deutlich höhere Flussraten bezüglich ihrer Anwendbarkeit zu testen.

Die zweite Regel widmet sich dem Übertragen von Gradienten auf Säulen anderer (typischerweise kleinerer) Dimensionen. Sie besagt im Sinne des Gradientenvolumen-Konzeptes, dass bei der Methodenübertragung das Verhältnis aus Gradientvolumen VG zu Säulenvolumen VC stets konstant gehalten werden muss. Das Säulenvolumen berechnet sich entsprechend aus den Säulendimension (innerer Durchmesser di und der Länge L).

(Bild: Thermo Fisher Scientific)

Unter Einhaltung dieser Regeln lassen sich Gradientenmethoden beschleunigen und auf effizientere Säulen übertragen, ohne dass sich die Auflösung der Peaks und das Muster des Chromatogrammes wesentlich verändern.

Eine wichtige Voraussetzung ist dabei das Vorhandensein einer Säule mit anderen Dimensionen, aber äquivalentem Packungsmaterial. Hier können die jeweiligen Säulenhersteller Hilfestellung leisten.

In Abbildung 1 sind die Regeln aus dem Gradientenvolumen-Konzept nochmals an einem Beispiel illustriert.

Abgestimmte Vorgehensweise bringt optimale Ergebnisse

Besonders effektiv ist die Methodenbeschleunigung, wenn in abgestimmter Weise Säulendimensionen, Teilchengröße der stationären Phase, Flussraten und Gradientenprofile optimiert werden. Ein praktisches Beispiel soll dies verdeutlichen: Ausgangssituation ist eine 250 mm lange Trennsäule, gepackt mit 5-µm-Phasenmaterial und betrieben mit einem Gradientenprogramm, dessen linear ansteigendes Hauptsegment 10 Minuten dauert.

Den grundlegenden Regeln (Mehr zu diesen Regeln finden Sie in unserem Übersichtsartikel.) folgend, soll die Methode von einem Transfer auf eine kürzere Säule mit effizienteren 3-µm-Partikeln profitieren. Entsprechend der Verringerung des Teilchendurchmessers dp von 5 µm auf 3 µm, wird die Säule um diesen Faktor auf 150 mm verkürzt. Gemäß der van-Deemter-Theorie muss sich die mobile Phase um diesen Faktor schneller durch die Säule bewegen. Um Lösemittel einzusparen und hohe Flussraten zu vermeiden, wurde aber gleichzeitig der Säulendurchmesser von 4,6 mm auf 2,1 mm reduziert. Wie muss nun das Gradientenprogramm angepasst werden, um dem Gradientenvolumen-Konzept zu entsprechen?

Die neue Zielflussrate wird aus der Ausgangsflussrate und den Verhältnissen der Teilchen- und Säulendurchmesser nach folgender Formel bestimmt:

(Bild: Thermo Fisher Scientific)

Sie beträgt in diesem Fall 0,5 ml/min und durch die wesentlich engere Säule wird bei ungefähr einem Drittel der ursprünglichen Flussrate eine 67% höhere lineare Strömungsgeschwindigkeit u in der Säule erzeugt (sie steigt von 2,2 mm/s auf 3,7 mm/s).

Die Säulenvolumina VC werden über das Volumen eines Zylinders mit 4,6 mm ID und 250 mm Länge bzw. 2,1 mm ID und 150 mm Länge berechnet. Das Säulenvolumen wird demnach von 4,15 ml auf 0,52 ml gesenkt. Damit stehen alle Angaben zur Verfügung, die zur Definition des neuen Gradientenprogramms gebraucht werden. Einsetzen in die in Abbildung 1 gezeigte Formel ergibt eine Segmentdauer von 3,6 Minuten anstatt der früheren 10 Minuten. Anschließend transferiert man die übrigen Gradientensegmente (Spülen der Säule und Äquilibrierung) um den gleichen Faktor.

Moderne Chromatographie-Datensysteme (CDS) wie das Thermo Scientific Chromeleon 7.2 CDS integrieren entsprechende Umrechnungsassistenten bereits in den Methodeneditor und erlauben damit ein schnelles, komfortables und fehlerfreies Übertragen und Beschleunigen von LC-Trennungen. Es finden sich aber auch Konversionsrechner im Internet.

Wie „steil“ sollte der Gradient sein?

Gibt es Empfehlungen, welches Gradientenvolumen VG geeignet ist, wenn eine neue Methode entwickelt wird? Es gibt solche Anhaltspunkte, abhängig davon, welchen Zweck die neue Methode verfolgen soll, wobei drei Fälle unterschieden werden können. Dabei gilt jeweils das Verhältnis zum eingesetzten Säulenvolumen VC als Maßstab.

Ein kleines Gradientenvolumen (VG ≤ 5 x VC) führt zu schmalen Peaks, damit zu einer vergleichsweise hohen Konzentra­tion an Analyt im eluierten Peak, also gutem Signal-Rauschen-Verhältnis im Detektor, jedoch relativ geringer Auflösung. Dies eignet sich gut zur Spurenanalytik bei moderat komplexen Proben. Ein mittelgroßes Gradientenvolumen VG von etwa 6 bis 15 Säulenvolumina VC stellt einen guten Kompromiss zwischen Auflösung und Analysendauer dar. In diesem Bereich sollte die Entwicklung von üblichen Methoden gestartet werden.

Ein sehr großes Gradientenvolumen (VG > 15 x VC) wird für die komplexe Multikomponentenanalyse empfohlen. Es erzeugt eine hohe Peakkapazität bei relativ langer Analysendauer. Einen Wert von VG = 30 x VC zu überschreiten, bringt jedoch kaum noch einen Gewinn an Auflösung.

Abschließend ein Beispiel, das die Auswirkung das Gradientenvolumens auf die Gestalt eines Chromatogrammes verdeutlicht. In Abbildung 2 wurde das VG/VC-Verhältnis durch Ändern von tG und/oder F bei konstanter Säule variiert. Es ist offensichtlich, dass mit sinkendem VG/VC

  • Peaks schmäler werden und die Peakhöhe steigt,
  • die allgemeine Auflösung sinkt, aber ebenso die Analysenzeit sowie
  • Selektivitäten zwischen bestimmten Peakpaaren sich verändern können.

Der Vergleich von a) und b) aus Abbildung 2 zeigt: Solange VG/VC bei Werten oberhalb von 5 liegt, ist die Gesamtauflösung relativ robust, ein kleineres VG erlaubt die Trennung aber deutlich zu beschleunigen. Änderungen der relativen Retention lassen sich an der Lage und Auflösung der kleineren Peaks (Verunreinigungen) erkennen. Methode c) erlaubt noch immer die Hauptkomponenten aufzulösen und dies bei erheblicher Einsparung von Zeit und Lösemittel, Verunreinigungen können hier jedoch nicht mehr aufgelöst werden.

* Dr. F. Steiner, Dr. M. M. Martin: Thermo Fisher Scientific, 82110 Germering

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