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Größenbestimmung Größe von Proteinen und Makromolekülen mit GPC/SEC bestimmen

Autor / Redakteur: Jean-Luc Brousseau* und Bernd Tartsch**, / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Um die Wirkungsweise von Proteinen und anderen Makromolekülen im Rahmen der Wirkstoffentwicklung zu verstehen, ist die genaue Kenntnis der räumlichen Struktur des Moleküls unablässig. Die Größenausschlusschromatographie mit Dreifachdetektion ist eine verlässliche und praktikable Methode zur exakten Größenbestimmung von Molekülen, die zudem keine Größeneinschränkungen aufweist.

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Abb 3: Das für die SEC mit Dreifachdetektion verwendete Viscotek Model 302 Triple Detector Array (TDA).
Abb 3: Das für die SEC mit Dreifachdetektion verwendete Viscotek Model 302 Triple Detector Array (TDA).
( Bild: Malvern Instruments )

Proteine spielen als Wirkstoffe in der Medizin eine immer wichtigere Rolle. Einsatzgebiete wie Diabetes, Multiple Sklerose oder verschiedene Krebsarten sind heute in vielen Fällen schon Standard. Der Einsatz und die Entwicklung von Proteinen als therapeutische Antikörper wecken für die Zukunft große Hoffnungen für viele bisher unheilbare Krankheiten.

Die Funktionalität eines Proteins ist von seiner Struktur abhängig, denn die räumliche Struktur bedingt dessen Wirkungsweise. Diese zu verstehen, ist für die Entwicklung der Proteine aber auch für die Bestimmung der Qualität im Herstellungsprozess von großer Bedeutung. Hier ist die Gelpermeationschromatographie/Größenausschlusschromatographie (GPC/SEC, engl. Size Exclusion Chromatography) die Methode der Wahl.

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Die Hauptanwendung der GPC/SEC ist die Bestimmung der Molekulargewichtsverteilung. Auch wird die Methode vielfach eingesetzt, um das Molekulargewicht mehrerer Proben miteinander zu vergleichen. Häufig lassen sich jedoch mithilfe des Molekulargewichts allein die Unterschiede zwischen den Proben nicht erklären. Insbesondere bei Molekülen deren biophysikalisches Verhalten von Bedeutung ist, wie Proteine und Polysaccharide, ist die Größe der Moleküle genauso wichtig oder sogar noch wichtiger als das Molekulargewicht.

Tatsächlich ist das Molekulargewicht von Proteinen häufig schon vor dem SEC-Experiment bekannt und die gesuchte Information ist die Größe des Proteins und die Menge und Größe von assoziierten Aggregaten.

Es gibt zwei Parameter, die häufig zur Definition der Größenangabe verwendet werden: der Trägheitsradius Rg (engl. radius of gyration) und der hydrodynamische Radius RH. Einfach dargestellt, ist der Trägheitsradius eine mathematisch definierte Größe, welche die Verteilung der Massepunkte im Molekül beschreibt. Im Gegensatz dazu ist der Trägheitsradius eine phänomenologische Eigenschaft des Moleküls. In der Praxis heißt dies, dass der hydrodynamische Radius, da er etwas über die Verhaltenweise des Moleküls aussagt, insbesondere für biologisch wichtige Moleküle die nützlichere Größe darstellt.

Bestimmung des Trägheitsradius durch Viskositätsmessungen

Die direkte Messung des Trägheitsradius ist nur durch die Messung der Streulichtintensität über dem Beobachtungswinkel möglich. Die Untergrenze für alle Detektoren, selbst unter idealen Bedingungen, beträgt 12 bis 15 nm. Das heißt, dass für fast alle Proteine und viele Kondensationspolymere der Trägheitsradius so nicht gemessen werden kann. Am oberen Ende der Größenskala besteht hingegen die Problematik, dass man nicht-lineare Daten anfittet. Für viele große Moleküle wie beispielsweise Polysaccharide erhält man daher mit winkelabhängigen Detektoren fehlerbehaftete Ergebnisse, sowohl bezüglich des Molekulargewichts als auch der Größe.

Eine gute Einschätzung des Trägheitsradius erhält man hingegen aus Viskositätsmessungen. Die Flory-Fox-Gleichung beschreibt den Zusammenhang zwischen Molekulargewicht, intrinsischer Viskosität [η] und dem Trägheitsradius:

M [η] = 63/2Φ0R3g

Hydrodynamischen Radius mit Dreifachdetektion messen

Der hydrodynamische Radius kann auf zwei Arten bestimmt werden: Die erste Methode ist die dynamische Lichtstreuung. Diese Technik wird häufig im Batch-Verfahren eingesetzt, um die durchschnittliche Größe der gesamten Probe zu bestimmen. Eine sehr akkurate, präzise und insbesondere praktikable Methode zur Bestimmung des hydrodynamischen Radius aller Komponenten einer Probe ist die SEC mit Dreifachdetektion (engl. Triple Detection). Durch den Einsatz von Online-Lichtstreu-, Brechungsindex- und Viskositätsdetektion ist es direkt möglich, das Molekulargewicht und die intrinsische Viskosität der Probe an jedem Punkt des Chromatogramms genau zu bestimmen.

Dies erlaubt dann die einfache Bestimmung des hydrodynamischen Radius an jedem Punkt. Folgende Formel beschreibt den Zusammenhang zwischen Molekulargewicht, intrinsischer Viskosität und dem hydrodynamischen Radius:

M [η] = 4/3πυNAR3H

Ausstattung und Messbedingungen für die Größenbestimmung

Um die Anwendung der SEC mit Dreifachdetektion für die genaue Größenbestimmung zu demonstrieren, wurden folgende Geräte und Messbedingungen verwendet: Für die Messungen kam ein Viscotek Model 302 Triple Detector Array (TDA), ausgestattet mit Lichtstreudetektor, differenziellem Viskositäts- und Brechungsindexdetektor zum Einsatz. Zwei 30-cm-Trennsäulen (mixed bed) wurden zur Trennung der Proben verwendet. Als Laufmittel wurde Wasser mit 0,5 M LiNO3 bei einer Flussrate von 0,6 mL/min eingesetzt. Die verwendeten Proben waren Dextran T70 (Pharmacia) und Bovine Serum Albumin (Sigma). Die Probenkonzentration lag bei ca. 3 mg/mL, das Injektionsvolumen bei 100 µl. Für die Berechnung der Ergebnisse wurde die Omnisec-Software von Viscotek eingesetzt. Die Ergebnisse der Dextran-Probe sind in Abbildung 2 dargestellt, die Messwerte des BSA sind in Tabelle 1 zusammengefasst.

Für die Dextran-Probe wurde der hydrodynamische Radius über den gesamten Peak gemessen. Er deckt den Bereich von 3,38 nm bis 11,03 nm ab. Bemerkenswert ist das sehr gute Signal-zu-Rausch-Verhältnis auf allen drei Detektoren. Dies stellt die Qualität der berechneten Größenergebnisse sicher. Am oberen Ende der Verteilung ist eine leichte Krümmung des RH-Plots zu beobachten. Dies ist ein Hinweis auf die Verzweigung der Dextran-Moleküle. Die Daten aus dem Viskositätsdetektor können darüber hinaus für die Quantifizierung der Verzweigung verwendet werden. Setzt man die Dreifachdetektion für Proteine ein, so kann eindeutig zwischen dem Protein-Monomer und seinen Oligomeren unterschieden werden, wie in Tabelle 1 dargestellt ist. Hier wurde jeweils der gesamte Peak verwendet, um den mittleren Radius für den Monomer, Dimer und Trimer des BSA zu berechnen. Die Software kann ebenso, wie beim Dextran, den Verlauf des Radius über die gesamte Messung anzeigen. Da die Proteine diskrete Molekulargewichte für jeden Oligomerisierungszustand besitzen, ergeben sich hierfür auch diskrete Radien.

Fazit: Dreifachdetektion ist eine verlässliche Methode

Die Dreifachdetektion stellt eine praktikable und verlässliche Methode dar, um genaue Größen mit der Größenausschlusschromatographie zu bestimmen. Sie ist die einzige Technik, die keine Größeneinschränkungen nach oben oder unten besitzt. Die Dreifachdetektion kann daher für alle Makromoleküle, die mit der SEC analysiert werden können, eingesetzt werden.

*Malvern Instruments Inc., Westborough, MA, USA** Malvern Instruments GmbH, 71083 Herrenberg

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