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Gravimetrisches Dosiersystem

Honig in präzisen Dosen – Studie zur automatisierten Probenvorbereitung

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Halbautomatische Vorbereitung von Honigproben

Honig gehört zu den am meisten verfälschten Lebensmitteln auf dem globalen Markt [3-4]. In den vergangenen Jahren hat ein Konsortium aus Alnumed, Bruker Bio-Spin und QSI-q3 die NMR-Honey-Profiling-Methode entwickelt [5-7], die heute als wesentlicher Teil des Testregimes zur Eindämmung von Honigbetrug akzeptiert ist. Zunächst wurden Proben präpariert, indem eine festgelegte Menge Honig mit Milligramm-Genauigkeit in einen 10-ml-Messkolben überführt wird, um eine 25%-ige (w/v) Lösung für die anschließende NMR-Analyse herzustellen.

Obwohl das Verfahren hinreichend genau und wiederholbar ist, ist es aufgrund der stark klebrigen und viskosen Eigenschaften des Honigs sehr zeitaufwändig. Das gilt selbst, wenn der Honig erwärmt und so weniger zähflüssig gemacht wird. Im speziellen Fall von Honig muss die Erwärmung der Probe sehr vorsichtig und bei moderaten Temperaturen durchgeführt werden, um die Standardqualitätsparameter für Honig nicht zu verändern. Dies gilt insbesondere für 5-Hydroxmethylfurfural (5-HMF) [8-9], das ein Indikator für eine unangemessene Wärmebehandlung und/oder Lagerung ist. Eine schonende Erwärmung bei niedrigen Temperaturen ist dagegen mit einem erheblichen Zeitverlust verbunden – was kritisch ist in einem Markt, der sehr kurze Reaktionszeiten für analytische Ergebnisse verlangt. Um dieses Verfahren zu beschleunigen, kann das Wägeverfahren optimiert werden.

Unterschiedliche Wäge-Strategien

Normalerweise wiegt man eine fest vorgegebene Honigmenge so genau wie möglich ein und füllt diese Probe zu einem definierten Volumen auf. Schneller geht es, wenn die Honigmenge nur grob im Bereich der Zielvorgabe liegen muss. So lassen sich 20-ml- Standardglasfläschchen mit großer Öffnung etwa doppelt so schnell mit Honigproben vorbereiten, wenn das Zielgewicht irgendwo zwischen drei und vier Gramm liegt, statt bei einem exakten Wert von z.B. 3,50 g. Erst im Anschluss an die grobe Probeneinwaage erfolgt eine Präzisionswiegung der Menge Honig.

Aus deren Ergebnis wird die Lösungsmittelmenge berechnet, die benötigt wird, um die gleiche w/v-Konzentration wie bei der Zubereitung in einem Messkolben zu erreichen. Dabei ist jedoch die Dichte sowohl des Honigs als auch des Lösungsmittels zu berücksichtigen. Es ist einfach, die Dichte des Lösungsmittels (Wasser) mit einzubeziehen. Hierfür wird die Umgebungstemperatur manuell vor Beginn der Probenvorbereitung abgefragt und mittels LabX-Software die Wasserdichte ermittelt. Dabei ist wichtig, dass sich das verwendete Wasser im Temperaturgleichgewicht mit der Umgebung befindet.

Die Dichte von Honig – ein entscheidender Faktor

Um Schätzungen für die Dichte von Honig zu erhalten, wurde eine detaillierte Studie mit repräsentativen Honigproben durchgeführt. Insgesamt wurden 150 Honigproben weltweiter Herkunft (77 Wald-/Honigtauhonige(1) und 73 Blütenhonige) auf einem DX45 auf ihre Dichte geprüft.(2) Honigtauhonig (1,4252 g/cm3 mit U(k=2) = 0,0147 g/cm3 (± 1,03%) und Blütenhonige (1,4168 g/cm3 mit U(k=2) = 0,0111 g/cm3 (± 0,79 %)) wiesen geringfügig unterschiedliche mittlere Dichten auf, die ihre Ursache in der systematisch unterschiedlichen Zusammensetzung dieser Honigsorten haben kann. Allerdings ist der Unterschied mit 0,0084 g/cm3 (0,59%) unter Berücksichtigung der natürlichen Schwankungen vernachlässigbar, sodass für die Dichte von Honig ein allgemeiner Durchschnittswert von 1,42 g/cm3 (U(k=2) = 0,016 g/cm3 (± 1,09%)) angesetzt werden kann.

Abbildung 1: Variabilität der Dichte in natürlichen Honigen. Blau: Blütenhonig, Orange: Honigtau-Honig. Der hier vorgestellte Mittelwert von 1,42 g/cm3 berücksichtigt auch, dass die große Mehrzahl der Handelsware Blütenhonige sind. Die Fehlerbalken geben die Standardabweichung aus typischerweise drei Wiederholungsmessungen an, die im Mittel aller Proben kleiner als +/- 0,05% ist (0,0007 g/cm3).
Abbildung 1: Variabilität der Dichte in natürlichen Honigen. Blau: Blütenhonig, Orange: Honigtau-Honig. Der hier vorgestellte Mittelwert von 1,42 g/cm3 berücksichtigt auch, dass die große Mehrzahl der Handelsware Blütenhonige sind. Die Fehlerbalken geben die Standardabweichung aus typischerweise drei Wiederholungsmessungen an, die im Mittel aller Proben kleiner als +/- 0,05% ist (0,0007 g/cm3).
(Bild: Schwarzinger et al.)

Maßgeblich für die gemessenen Schwankungen der Honigdichte ist der Wassergehalt der Honige [10]. Honig darf – mit wenigen Ausnahmen – gemäß Verordnung maximal 20% Wasser enthalten [8-9]. Die Restfeuchte der hier untersuchten Honige betrug unter 20%(3). Handelsware fällt oft in den Bereich 17 bis 18% Wassergehalt, ab dem eine Gärung des Honigs während der Lagerung im Verkaufsregal unwahrscheinlich ist [11]. In extremen Fällen können Honige auch nur 14% oder weniger Wasser enthalten. Diese natürlich auftretende Schwankungsbreite des Wassergehaltes ist aber im untersuchten Probensatz abgedeckt und somit in der oben angegebenen Streuung der Honigdichte um den Durchschnittswert bereits enthalten.

Bei 95% der hier untersuchten Proben liegt die relative Schwankung der Dichte um den Mittelwert bei ± 1,09% (1,406 bis 1,437 g/cm3). Infolge der Zugabe des Lösungsmittels verringert sich dieser Wert weiter und führt zu Abweichungen von weniger als 0,16% in der fertigen (w/v)-Probenlösung, sodass eine Anpassung der Dichte an den Wassergehalt des Honigs an dieser Stelle nicht nötig ist. Vorsicht ist allerdings bei unreif geernteten Honigen oder reinen Zuckersirupen geboten, die andere Wassergehalte bzw. Zuckerzusammensetzungen als natürliche Honige haben können.

Unreif geerntete Honige können Wassergehalte über 30% aufweisen und werden oft mit verbotenen technologischen Verfahren getrocknet [12]. Zusätzliche Tests mit solchen Proben (Feuchtigkeit über 30% im Extremfall) haben mit Dichten zwischen 1,39 g/cm3 und 1,31 g/cm3 deutlich geringere Werte ergeben (Δ(1,42-1,31 g/cm3) = 0,11 g/cm3 oder 7,8%). Selbst bei einem Honig mit einer Dichte von nur 1,31 g/cm3 würde die Abweichung nach der abgeschlossenen Probenvorbereitung weniger als 1,2% von der angestrebten (w/v)-Konzentration betragen, wenn mit der oben beschriebenen durchschnittlichen Honigdichte von 1,42 g/cm3 gearbeitet würde. Im Zweifelsfall kann eine Zweitmessung mit Präparation im Messkolben die Ergebnisse bei solchen Extremfällen absichern. Für natürlichen Honig ist das aber nicht notwendig.

Abbildung 2: Arbeitsablauf der semiautomatischen Vorbereitung einer Honigprobe für NMR-Messungen.
Abbildung 2: Arbeitsablauf der semiautomatischen Vorbereitung einer Honigprobe für NMR-Messungen.
(Bild: Schwarzinger et al.)

(1) Wald-/Honigtauhonige waren entweder als solche deklariert oder wiesen eine elektrische Leitfähigkeit von >= 0,8 mS auf. Die Leitfähigkeit wurde mit einem Mettler Toledo „Seven Compact Conductivity“ Messgerät bei Raumtemperatur gemäß BVL L 40.00-5:2003-12 (entsprechend DIN 10753) gemessen.
(2) Vor der Analyse wurden die Honigproben homogenisiert. Zur Bestimmung der Dichte auf einem DX45 wurden ca. 15 bis 20 ml in Glasfläschchen abgefüllt, die verschlossen bei 50° C inkubiert wurden bis der Honig sich verflüssigt hatte, um das Laden in die Kapillare zu erleichtern. Warme Fläschchen wurden mit einem Deckel versehen und auf den Probenwechsler SC1 gestellt und sofort in die Kapillare des DX45 geladen. Die Messungen wurden bei 24 °C durchgeführt. Mindestens zwei unabhängige Messungen wurden gemittelt. Das DX45 wurde mit der LabX-Software gesteuert.
(3) Der Feuchtegehalt der Honigproben wurde mit einem über LabX gesteuerten RM50 nach BVL L 40.00-2:1992-12 (entsprechend DIN 10752) bestimmt.

Protokoll für gravimetrische Probenpräparation von Honig

Schließlich wurde ein schnelles und hochgradig reproduzierbares Protokoll für die semi-automatische gravimetrische Probenpräparation von Honig entwickelt, bestehend aus:

  • schnelle Grobdosierung von Honig (3 bis 4 g) in ein Fläschchen mit ausreichend großer Öffnung
  • Präzisionswiegung des dosierten Honigs
  • Berechnung des Volumens des Honigs und der Wassermenge (Gewicht) auf das Äquivalent der w/v-Konzentration des volumetrischen Verfahrens, erreicht durch die LabX-Software
  • gravimetrische Präzisionsdosierung von Wasser mithilfe des Mettler-Toledo Quantos-Moduls zur Flüssigkeitsdosierung.

Die Validierung der Methode mittels NMR-Honey-Profiling durch Messung von Proben, die sowohl mit der manuellen volumetrischen als auch mit der halbautomatischen gravimetrischen Methode vorbereitet wurden, ergab keine signifikanten Unterschiede in den Ergebnissen. Zusätzlich zur Reproduzierbarkeit wurde der Zeitaufwand für die Probenvorbereitung jedoch drastisch reduziert werden, sodass der Probendurchsatz pro Person erheblich stieg.

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