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Steroidhormon-Anreicherung aus Oberflächengewässern Hormone im Griff?

Autor / Redakteur: Jan Funke*, Michelle Diederichs**, Dr. Peter Balsaa*, Prof. Dr. Torsten C. Schmidt* / Dr. Ilka Ottleben

Hormone werden vielfach zu therapeutischen Zwecken eingesetzt. Nebeneffekt: Früher oder später gelangen sie auch in unsere Gewässer und können so als endokrine Disruptoren Mensch und Umwelt gefährden. Empfindliche Analytik ist daher gefragt. Die verfügbaren LC-MS/MS-Systeme sind jedoch für ein Direktinjektionsverfahren noch nicht sensitiv genug. Die Lösung heißt deshalb: gezielte Anreicherung. Hier am Beispiel von Steroidhormonen vorgestellt.

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Abb. 1: Die Steroidhormone 17 α -Ethinylestradiol (EE2), 17 β -Estradiol (E2) und Estron (E1) werden über menschliche Ausscheidungen ins Abwasser und somit auch in Oberflächengewässer eingetragen.
Abb. 1: Die Steroidhormone 17 α -Ethinylestradiol (EE2), 17 β -Estradiol (E2) und Estron (E1) werden über menschliche Ausscheidungen ins Abwasser und somit auch in Oberflächengewässer eingetragen.
(Bild: © Yaar- stock.adobe.com)

Hormone haben einen verantwortungsvollen Job: In unserem Körper regeln sie unzählige essenzielle Funktionen und das auch in minimaler Dosierung. Ihr Zusammenspiel im endokrinen System ist dabei sehr gut aufeinander abgestimmt, geringste Abweichungen können große Folgen haben. Sie verdienen daher zu Recht große Beachtung. Neben den Hormonen werden auch andere organische Spurenstoffe als potenzielle endokrine Disruptoren in die Umwelt eingetragen.

Potenzielle endokrine Disruptoren: Steroidhormone unter Beobachtung

Die Steroidhormone 17α-Ethinylestradiol (EE2), 17β-Estradiol (E2) und Estron (E1) aus der Gruppe der Östrogene sind endokrin wirksame Substanzen, welche über menschliche Ausscheidungen ins Abwasser gelangen und somit auch in Oberflächengewässer eingetragen werden [1]. Aufgrund ihrer endokrinen Eigenschaften wurden diese Stoffe in die Beobachtungsliste „Watch-List“, welche Teil des Artikels 8 der Richtlinie 2008/105/EG ist, aufgenommen.

Ergänzendes zum Thema
Endokrine Disruptoren

Endokrin wirksame Substanzen sind Stoffe, die auf die Hormonaktivität des Körpers Einfluss nehmen oder sie stören können. Führt dies zu Beeinträchtigungen, werden sie als endokrine Disruptoren bezeichnet. Menschen und Tiere können über die Ernährung und andere Quellen einer Vielzahl von endokrin wirksamen Stoffen ausgesetzt sein. In den letzten Jahren häufen sich die Bedenken, dass endokrine Disruptoren endokrine Krankheiten und Störungen sowie hormonabhängige Krebsarten fördern und die Fortpflanzungsfähigkeit und Entwicklung beeinträchtigen könnten.

Die Mitgliedstaaten der EU sind demnach seit 2015 dazu aufgefordert, im Rahmen einer Analyse der Gesamtwasserprobe (whole water sample) Daten zu sammeln, um eine zukünftige Priorisierung von Schadstoffen durch die Kommission zu unterstützen [2]. Derzeit ist jedoch keines der am Markt verfügbaren LC-MS/MS-Systeme in der Lage, die in der „Watch-List“ aufgeführten höchstzulässigen Nachweisgrenzen mittels Direktinjektion zu erreichen [3]. Die Notwendigkeit möglichst rasch ein robustes Verfahren zu etablieren, wird auch dadurch deutlich, dass sich im DIN-Normausschuss Wasserwesen (NAW) der Arbeitskreis 16 „LC-MS/MS-Verfahren“ mit genau diesen Parametern beschäftigt.

Im Rahmen eines Projekts wurden grundlegende Erkenntnisse gesammelt, um ein robustes, routinetaugliches Verfahren mittels Festphasenextraktion (Solid Phase Extraction, SPE) zu etablieren, bei dem die
Bestimmung der Hormonkonzentration in der Gesamtwasserprobe
berücksichtigt wurde. Für die Optimierung des Verfahrens wurden verschiedene SPE-Materialien, unterschiedliche Methoden der Probenstabilisierung und die Lagerung von SPE-Kartuschen nach der Anreicherung untersucht. Zusätzlich erfolgten Experimente mithilfe der Flüssig-Flüssig-Extraktion.

Optimierung des Verfahrens

Bei der Optimierung wurde als Kenngröße die Wiederfindungsrate (WFR) betrachtet. In einem bestehenden Routineverfahren (SPE-LC-MS/MS) wird für die Hormonanalytik ein Wasservolumen von 1000 mL aufgearbeitet und auf 1000 µL Endvolumen aufkonzentriert. Die Messungen wurden an einem LC-MS/MS von Waters (Acquity-LC-System gekoppelt an ein TQD-Massenspektrometer) im ESI+ Modus durchgeführt. In den Tabellen 1, 2 und 3 (s. Bildergalerie) sind die optimierten Methodenparameter zusammengefasst.

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  • SPE-Materialien: Bei der SPE-Anreicherung wurden folgende Materialien getestet: HLB (Waters; 6 mL/200 mg), Polar Plus (Avantor; 6 mL/1000 mg), Strata-XL (Phenomenex; 3 mL/200 mg) sowie ENV+ (Biotage; 3 mL/200 mg und 6 mL/100 mg). Die nachfolgenden Arbeitsschritte waren für alle Materialien gleich. Es wurde mit 2 x 2 mL Acetonitril und 2 x 2 mL UPLC-Wasser konditioniert. Die Anreicherung der Wasserprobe erfolgte mit einem Volumenstrom von 15 mL/min. Anschließend wurden die Kartuschen 40 min im Stickstoffstrom getrocknet und dann mit 5 x 2 mL Acetonitril eluiert. Aufkonzentriert bis zur Trockene wurde das organische Extrakt im Wasserbad bei 45 °C im Stickstoffstrom. Der Rückstand wurde mit 500 µL UPLC-Wasser und 500 µL Acetonitril resolvatisiert. Von jeder Probe wurde eine Dreifachbestimmung durchgeführt. In weiteren Versuchen wurden auch die SPE-Disks „HLB“ (High, Medium, Low), „C18“, „DVB“ und „One Pass“ von Horizon eingesetzt.
  • Lagerung und Stabilisierung: Um eine Aussage über matrixbelastete Proben treffen zu können, wurden sowohl Trinkwasserproben als auch Oberflächenwasserproben (Ruhr) bearbeitet. Der Versuch erstreckte sich über eine Dauer von zwei Wochen, wobei die ersten Proben sofort aufgearbeitet und gemessen wurden, weitere Aufarbeitungen und Messungen wurden nach einer Woche und zwei Wochen Lagerung bei 4 bis 8 °C durchgeführt. Die Stabilisierung erfolgte durch 40 mg/L Natriumazid und durch Ansäuern (HCl, pH 2). Die SPE-Anreicherung erfolgte mittels HLB-Kartuschen (Waters; 6 mL/200 mg).
  • Lagerung von getrockneten HLB-Kartuschen: In weiteren Versuchen wurde getestet, ob eine Unterbrechung bei der Aufarbeitung nach dem Trocknen der beladenen Kartusche möglich ist und wie sich die WFR bei verschiedenen Lagerungsbedingungen verändern. Ein Teil der Kartuschen wurde am selben Tag eluiert und gemessen, die übrigen Kartuschen wurden im Gefrierschrank a) bei -16 °C, b) im Abzug vor Sonnenlicht geschützt, bei Raumtemperatur (RT) und c) im Exsikkator unter Vakuum bei RT gelagert. Die weitere Aufarbeitung und Messung dieser Kartuschen erfolgte nach sieben bzw. nach vierzehn Tagen.
  • Zugabe von Sediment: Weitere Experimente sollten zeigen, ob die WFR durch die Zugabe von Sediment beeinflusst wird. Dazu wurden 100 mL Trinkwasser mit 100 mg Sediment versetzt. Die Aufarbeitung erfolgte wie im Versuch SPE-Materialien mit HLB-Kartuschen.
  • Flüssig-Flüssig-Extraktion (FFE): Für die FFE wurden 10 mL einer Wasserprobe (Analytkonzentration: 300 ng/10 mL) mit 3 x 2 mL Ethylacetat extrahiert. Die organischen Extrakte wurden vereinigt und anschließend wie oben beschrieben zur Trockne eingeengt, der Rückstand wurde mit 1 mL Wasser/Acetonitril (50/50) gelöst, in ein Vial überführt und gemessen.

Ergebnisse

Abb. 2: Ergebnisse der WFR für EE2 bei Aufarbeitung von dotiertem Trinkwasser (300 ng/L) mit verschiedenen SPE-Materialien und unterschiedlicher Kartuschen- bzw. Diskvarianten.
Abb. 2: Ergebnisse der WFR für EE2 bei Aufarbeitung von dotiertem Trinkwasser (300 ng/L) mit verschiedenen SPE-Materialien und unterschiedlicher Kartuschen- bzw. Diskvarianten.
(Bild: IWW Rheinisch-Westfaelisches Institut für Wasser)

SPE-Materialien:
Der Einsatz von SPE-Kartuschen ermöglicht einen hohen Probendurchsatz und ist einfach zu handhaben. Bei den Disks ist die Aufarbeitung ohne ein geeignetes, automatisiertes Absaugsystem sehr zeitintensiv, da nur wenige Proben von einem Mitarbeiter gleichzeitig aufgearbeitet werden können. In Abbildung 2 sind exemplarisch die Werte für EE2 dargestellt.

Wiederfindungsraten:
Sehr gute WFR (> 90%) wurden sowohl mit den Materialien Strata XL, als auch mit HLB erreicht. Die WFR für ENV+ und Polar Plus sind mit ca. 60 bis 80% WFR noch gut. Im Vergleich zwischen 6 mL/100 mg und 3 mL/200 mg ENV+ zeigte es sich, dass auch die Sorbensmenge und die Geometrie der Kartusche einen Einfluss auf die WFR hat. Die erzielten WFR bei der Aufarbeitung mit den Disks lagen im Bereich von circa 40 bis 70%. Für E1, E2 und EE2 wurden die höchsten WFR mit den HLB Low (60 bis 70%) erreicht. Mit den C18 Disks wurden vergleichbare WFR (ca. 60%) erreicht. Bei den HLB-Varianten „High“ und „Medium“ sowie DVB und One Pass waren die WFR schlechter (40 bis 50%). Grundsätzlich wurde festgestellt, dass im Vergleich Kartusche/Disk die Disks deutlich schlechtere WFR lieferten.

Abb. 3: Ergebnisse der WFR von EE2 bei Aufarbeitung von dotiertem Oberflächen- und Trinkwasser (300 ng/L) mit verschiedenen Stabilisierungsmethoden und einer Lagerdauer von bis zu zwei Wochen.
Abb. 3: Ergebnisse der WFR von EE2 bei Aufarbeitung von dotiertem Oberflächen- und Trinkwasser (300 ng/L) mit verschiedenen Stabilisierungsmethoden und einer Lagerdauer von bis zu zwei Wochen.
(Bild: IWW Rheinisch-Westfaelisches Institut für Wasser)

Lagerung und Stabilisierung:
Aus den in der Abbildung 3 exemplarisch dargestellten Ergebnissen für EE2 ist erkennbar, dass Matrixeffekte bei der Anreicherung von Hormonen eine Reduzierung der WFR von über 20% bewirken. Eindeutig konnte gezeigt werden, dass die Zersetzung der Substanzen bei einer Lagerung im matrixbelasteten Wasser (Ruhr) schneller voranschreitet als im Trinkwasser. Sowohl für Trink- als auch für Oberflächenwasser ergibt die Lagerung bei pH 2 keinen positiven Stabilisierungseffekt. Beim Ruhrwasser zeigt sich jedoch, dass durch den Zusatz von Natriumazid die Zersetzung der Analyten im Vergleich zu den Proben ohne Stabilisierung langsamer ist.

Abb. 4: Ergebnisse der WFR von EE2 bei Aufarbeitung von dotiertem Trinkwasser (300 ng/L) und der Lagerung von getrockneten HLB-Kartuschen bis zu zwei Wochen bei unterschiedlichen Lagerbedingungen.
Abb. 4: Ergebnisse der WFR von EE2 bei Aufarbeitung von dotiertem Trinkwasser (300 ng/L) und der Lagerung von getrockneten HLB-Kartuschen bis zu zwei Wochen bei unterschiedlichen Lagerbedingungen.
(Bild: IWW Rheinisch-Westfaelisches Institut für Wasser)

Lagerung von getrockneten HLB-Kartuschen:
Abbildung 4 zeigt die WFR bei den getrockneten HLB-Kartuschen nach sofortiger Messung und nach sieben und 14 Tagen. Es zeigt sich, dass die Erhöhung der Lagerdauer von einer auf zwei Wochen kaum Auswirkungen auf die WFR hatte. Außerdem ist zu erkennen, dass eine Lagerung der Kartuschen im Gefrierschrank die geringste Abnahme der WFR mit circa 5% zur Folge hatte, gefolgt von einer Lagerung im Exsikkator mit knapp 80%. Die geringsten WFR mit circa 75%, aber dennoch nur einer geringen Abnahme von circa 10%, wurden bei der Lagerung im Abzug bei Normaldruck und RT erreicht.

Abb. 5: Ergebnisse der WFR bei Aufarbeitung von dotiertem Trinkwasser (300 ng/L) mit 100 mg Sediment/100 mL
Abb. 5: Ergebnisse der WFR bei Aufarbeitung von dotiertem Trinkwasser (300 ng/L) mit 100 mg Sediment/100 mL
(Bild: IWW Rheinisch-Westfaelisches Institut für Wasser)

Sedimentzugabe:
Anhand von Abbildung 5 ist zu erkennen, dass die Zugabe von Sediment (100 mg/100 mL) die WFR um 20 bis 30% verschlechtert.

Flüssig-Flüssig-Extraktion:
Mittels der FFE werden sehr gute WFR (92 bis 120%) für alle drei Analyten erzielt. Problematisch ist aus ökologischer Sicht die Wasserlöslichkeit des Ethylacetats von 95 mL pro Liter.

Fazit

Für ein routinetaugliches Verfahren ist, sowohl im Hinblick auf die WFR als auch auf die Handhabung, der Einsatz von SPE-Kartuschen zu empfehlen. Dabei konnten mit den Materialien Strata-XL und HLB sehr gute WFR erzielt werden.

Es ist ratsam, die Proben möglichst zeitnah nach der Probenahme zu bearbeiten, oder bei zwingender Lagerung Oberflächenwasserproben mit der Zugabe von Natriumazid zu stabilisieren. Eine gute Option bietet die gestaffelte Aufarbeitung. Die auf der SPE angereicherte Probe kann im getrockneten Zustand problemlos bis zu 14 Tagen im Gefrierschrank gelagert werden.

Die Ergebnisse des Sedimentversuches zeigen, dass irreversible Sorptionseffekte nicht auszuschließen sind. Ob diese Probleme durch den Einsatz von isotopenmarkierten Standards beherrschbar sind, muss in weiteren Versuchen überprüft werden.

Die Festphasenextraktion bietet die einfachste und schnellste Variante, um die Zielsubstanzen anzureichern. Darüber hinaus wäre es denkbar, dass diese Form der Anreicherung sogar unmittelbar bei der Probenahme durchgeführt werden kann.

Literatur

[1] Ripollés, C., Ibánez, M., Sancho, J. V., López, F. J., Hernández, F., Determination of 17β-estradiol and 17α-ethinylestradiol in water at sub-ppt levels by liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry, Anal. Methods, 2014, 6, 5028.

[2] GRICHTLINIE 2008/105/EG DES EUROPÄISCHEN PARLAMENTS UND DES RATES vom 16. Dezember 2008 über Umweltqualitätsnormen im Bereich der Wasserpolitik und zur Änderung und anschließenden Aufhebung der Richtlinien des Rates 82/176/EWG, 83/513/EWG, 84/156/EWG, 84/491/EWG und 86/280/EWG sowie zur Änderung der Richtlinie 2000/60/EG.

[3] Petrie, B., Youdan, J., Barden, R., Kasprzyk-Hordern, B., Multi-residue analysis of 90 emerging contaminants in liquid and solid environmental matrices by ultra-high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry, J. Chromatogr. A 1431 (2016) 64-78.

* J. Funke, Dr. P. Balsaa, IWW Rheinisch-Westfaelisches Institut für Wasser, 45476 Mülheim an der Ruhr; **M. Diederichs, Prof. Dr. T. C. Schmidt, Universität Duisburg-Essen, Instrumentelle Analytische Chemie und Zentrum für Wasser- und Umweltforschung, Universitätsstraße 5, 45141 Essen

(ID:45368955)