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Optimierte Wasseranalytik Hormonell wirksame Substanzen in wässrigen Matrices überwachen

Autor / Redakteur: Vanessa Hinnenkamp*,**, Peter Balsaa*, Torsten C. Schmidt*,** / Dr. Ilka Ottleben

Hormonell wirksame Substanzen gelangen nach der Ausscheidung in die Kläranlagen, wobei diese dort nicht vollständig entfernt werden können und somit in Gewässer eingetragen werden. Ein Umstand, den es aufgrund ihrer potenziell schädlichen Wirkung zu kontrollieren gilt.

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Abb. 1: Hormonell wirksame Substanzen wie 17α-Ethinylestradiol oder Estron finden sich auch in der aquatischen Umwelt.
Abb. 1: Hormonell wirksame Substanzen wie 17α-Ethinylestradiol oder Estron finden sich auch in der aquatischen Umwelt.
(Bild: gemeinfrei, [M] Heimerl)

Substanzen mit hormoneller Wirkung stellen im aquatischen Milieu nach wie vor ein umweltrelevantes Problem dar. Sie werden meist über Kläranlagenabläufe in Oberflächengewässer eingetragen und werden für die Verweiblichung von Fischen verantwortlich gemacht. Da Flüsse und Seen Lebensgrundlage für Menschen und aquatische Organismen sind, müssen die Einträge minimiert und regelmäßig kontrolliert werden. In der so genannten „Watchliste“ aus dem Durchführungsbeschluss (EU) 2015/495 sind erstmals auch estrogen aktive Substanzen (17α-Ethinylestradiol (EE2), 17β-Estradiol (E2) und Estron (E1) mit UQN-Werten aufgelistet [1]. Weil hormonelle Wirkungen bereits in sehr kleinen Konzentrationen beobachtet werden, sind UQN-Werte für 17α-Ethinylestradiol von 0,035 ng/L und für 17β-Estradiol sowie Estron von 0,4 ng/L festgelegt worden. Um diese Anforderungen überprüfen zu können, bedarf es sensitiver Analysenmethoden, wie der Flüssigchromatographie gekoppelt mit der Tandemmassenspektrometrie (LC-MS/MS).

Mit den bisher beschriebenen LC-MS/MS-Methoden, bei denen mit der Direkt­injektion eines großen Probenvolumens von bis zu 250 µL bzw. mittels eines Online-Anreicherungsverfahren gearbeitet wurde, konnten niedrige Bestimmungsgrenzen für wässrige Proben mit geringer Matrixbelastung erzielt werden [2]. Allerdings erwiesen sich die Methoden bei der Analyse von Realproben, besonders bei Oberflächenwässern, als ungeeignet für eine sensitive Bestimmung von hormonell wirksamen Substanzen. Innerhalb weiterer Untersuchungen wurde in dieser Arbeit auf eine Anreicherung der Proben mittels SPE-Kartuschen zurückgegriffen und dabei das Auftreten der Matrixeffekte analysiert.

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Methodenentwicklung

Die Methodenentwicklung erfolgte an einer Acquity-Ultrahochleistungsflüssigchromatographie-(UPLC)-Anlage gekoppelt mit einem Xevo-TQS-System (beides Waters). Für die chromatographische Auftrennung der Analyten wurde eine Waters-Acquity-HSS-T3-Säule (1,7 µm, 2,1 mm x 50 mm) bei einer Säulentemperatur von 40 °C mit einem Injektionsvolumen von 25 µL verwendet. Als mobile Phase wurden Wasser und Acetonitril mit einem Anteil von je 0,1% Ameisensäure und einer Flussrate von 0,35 mL/min gewählt. Die chromatographische Trennung der Analyten sowie der Verlauf des Gradienten sind in Abbildung 2 dargestellt. Die Elektrosprayionisierung erfolgte hier, anders als in vielen publizierten Arbeiten beschrieben, im positiven Modus [3-6]. Für die MRM-Methode wurden mithilfe des automatischen Tunes die zwei sensitivsten Übergänge vom jeweiligen Vorläuferion zu den spezifischen Fragmentionen ermittelt. Um möglichst niedrige Bestimmungsgrenzen zu erhalten, wurde darüber hinaus eine Anreicherungsmethode entwickelt.

Dazu wurden 1000 mL der Proben über eine Oasis-HLB-Kartusche der Firma Waters (Konditionierung mit 2 mL Methanol und 2 mL Wasser) angereichert. Danach wurde das Sorbens im Stickstoffgasstrom 15 min getrocknet. Anschließend erfolgte die Elution mit je 2 x 5 mL Methanol, die erforderlich waren, um die Substanzen nahezu vollständig von dem Sorbens zu eluieren. Nach der Elution wurde das organische Extrakt im Stickstoffgasstrom bis zur Trockene eingeengt. Anschließend erfolgte das Lösen der Analyten in 200 µL Wasser/Acetonitril (95:5). Für die einzelnen Substanzen konnten Wiederfindungsraten im Reinstwasser von 79 bis 105% und Bestimmungsgrenzen von < 10 ng/L erreicht werden, wobei die vorgeschlagenen UQN-Werte noch nicht erhalten werden können.

Störende Matrixeffekte

Störende Matrixbestandteile führen oft dazu, dass die im Reinstwasser erhaltenen Bestimmungsgrenzen angehoben werden müssen. Aus diesem Grund sollte dieses Problem gesondert betrachtet werden. Zur Untersuchung des Matrixeinflusses auf die Zielanalyten wurden weitere Versuche mit Extrakten eines Quellwassers, eines über Aktivkohle filtrierten Trinkwassers (AKF-Wasser) und eines Oberflächenwassers herangezogen und diese mit je 100 ng/L an Analyten dotiert. Als Kenngröße für den Matrixeffekt diente die Wiederfindungsrate (WFR). Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in der Tabelle 1 zusammengefasst.

Die Wiederfindungsraten des Quellwasserextraktes zeigen, dass durch die geringe Matrixbelastung kaum Einflüsse, außer für das 17α-Ethinylestradiol, zu beobachten sind. Im Gegensatz dazu zeigten die Messungen des AKF-Extraktes bereits deutlich Minderbefunde, hier liegen die Wiederfindungsraten nur noch im Bereich von 14 bis 49%. Im Oberflächenwasserextrakt konnte der größte Effekt innerhalb der untersuchten Matrices beobachtet werden. Hier wurden besonders kleine Wiederfindungsraten bei den Analyten 17β-Estradiol, Estriol, Estron und 17α-Ethinylestradiol beobachtet, während 16α-Hydroxyestron nicht mehr nachweisbar war. Im Gegensatz dazu wurde für Mestranol sogar eine Signalerhöhung festgestellt.

Matrixbestandteile können einerseits die Ionisation direkt beeinflussen. Andererseits können sie sich jedoch auch nachteilig auf die Aufnahme der Extrakte nach dem Einengen auswirken. Ist der Wasseranteil der Lösemittel zu hoch, so verhindern die mitangereicherten Matrixbestandteile, dass die Zielanalyten ausreichend gelöst werden. Wird der organische Anteil deutlich erhöht, verschlechtert sich die chromatographische Trennung. Im Chromatogramm kommt es zu Peakverbreiterungen beziehungsweise unsymmetrischen Peaks.

Weiterentwicklungen nötig

Für die Analytik von hormonell wirksamen Substanzen in wässrigen Matrices sind nach wie vor Anreicherungsverfahren nötig, um Bestimmungsgrenzen im Spurenbereich zu erreichen. Mit der hier beschriebenen Methode ist es noch nicht möglich, die geforderten Bestimmungsgrenzen für 17α Ethinylestradiol von 0,035 ng/L und für 17β-Estradiol sowie Estron von 0,4 ng/L zu erhalten. Hier steht noch Bedarf an Weiterentwicklungen an, um die Analyten sensitiver bestimmen zu können. Im ersten Schritt soll dazu eine Large-Volume-Injektion getestet werden, d.h. es soll nahezu das gesamte Extrakt injiziert werden. Zudem soll das Lösungsverhalten der Hormone, hinsichtlich ausreichender und mit der Chromatographie kompatibler Anteile an Organik im Lösemittel, für die Aufnahme der Rückstände getestet werden. Zur Kompensation der Matrixeffekte sollen interne, isotopenmarkierte Standards bzw. das Standardadditionsverfahren zum Einsatz kommen. Diese Vorgehensweise setzt aber eine ausreichende und reproduzierbare WFR (>70%) voraus.

[Dieses und weitere Themen rund um die Wasseranalytik werden auf dem 2. Wasseranalytischen Seminar in Mülheim an der Ruhr vom 14. bis 19. September diskutiert. Mehr zum MWAS 2016 gibt es hier.]

Literatur

[1] Durchführungsbeschluss (EU) 2015/495 der Kommission vom 20. März 2015 zur Erstellung einer Beobachtungsliste von Stoffen für eine unionsweite Überwachung im Bereich der Wasserpolitik gemäß der Richtlinie 2008/105/EG des Europäischen Parlaments und des Rates (Bekanntgegeben unter Aktenzeichen C(2015) 1756), Brussels, 2015.

[2] F. Werres, P. Balsaa, S. Kowal, K. Lang, Nachweis von Steroid-Hormonen in Wasser mittels HPLC-MS/MS. LABORPRAXIS, 2013.

[3] M. Pedrouzo, F. Borrull, E. Pocurull, R. M. Marcé, Estrogens and their conjugates: Determination in water samples by solid-phase extraction and liquid chromatography–tandem mass spectrometry. Talanta, 2009, 78, p. 1327–1331.

[4] R. A. Trenholm, B. J. Vanderford, J. C. Holady, D. J. Rexing, S. A. Snyder, Broad range analysis of endocrine disruptors and pharmaceuticals using gas chromatography and liquid chromatography tandem mass spectrometry. Chemosphere, 2006, 65, p. 1990–1998.

[5] C. Wang, P. R. Gardinali, Comparison of multiple API techniques for the simultaneous detection of microconstituents in water by on-line SPE-LC-MS/MS. Journal of Mass Spectrometry. 2012, 47, p. 1255–1268.

[6] M. Henriques, V.Cardoso, A. M. Rodrigues, E. Ferreira, M. J. Benoliel, C. M. Almeida,Simultaneous Determination of Ten Endocrine Hormone Disrupters in Water Using SPE/LC-(ESI)MS-MS. Journal of Water Resource and Protection, 2010, 2, p. 818-829.

* V. Hinnenkamp, P. Balsaa, T. C. Schmidt: IWW Zentrum Wasser, 45476 Mülheim an der Ruhr

* *V. Hinnenkamp, T. C. Schmidt: Universität Duisburg-Essen, Fakultät für Chemie, IAC, 45141 Essen

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